通用型細(xì)菌鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
通用型細(xì)菌鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑是一種旨在根據(jù)保守性序列設(shè)計(jì)引物，針對微生物樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步測序后借助分析工具予以同源比較，由可變序列識(shí)別和分類微生物樣品的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诟鞣N微生物的鑒定、歸類、建樹等系統(tǒng)微生物學(xué)的研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，擴(kuò)增效率顯著。
技術(shù)背景
16SrRNA作為非培養(yǎng)依賴性標(biāo)記的分子指模（fingerprinting）技術(shù)，有別于傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)技術(shù)，用于研究微生物的分類學(xué)（phylogenetics）。核糖體RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物體內(nèi)，且結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化保留；容易分離和識(shí)別；其一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度進(jìn)化保守區(qū)域（conserved region）和物種特異性可變區(qū)域（variable region）；其基因序列變異非常緩慢，且不會(huì)發(fā)生平行基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分；23S不穩(wěn)定；而微生物16SrRNA基因較為穩(wěn)定，初級(jí)結(jié)構(gòu)含有1500個(gè)堿基。通過引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，數(shù)據(jù)庫對照，鑒定微生物的類別或建立新的微生物在進(jìn)化樹上的位置。
產(chǎn)品內(nèi)容
擴(kuò)增液（Reagent A） 微升
引物液（Reagent B） 微升
補(bǔ)充液（Reagent C） 毫升
測序引物A（Reagent D） 微升
測序引物B（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
PCR級(jí)礦物油：用于封隔反應(yīng)液
PCR儀：用于樣品擴(kuò)增
PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器
瓊脂糖凝膠電泳：用于擴(kuò)增后電泳分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作： 
1． 針對一個(gè)樣本，每次移出 15 微升 擴(kuò)增液（Reagent A）到 PCR 管
2． 加入 1 微升用戶自備的的待測 DNA 樣品（總量 100 納克）
3． 微升 引物液（Reagent B）
4． 再加入 微升 補(bǔ)充液（Reagent C）（反應(yīng)總量為 25 微升）
5． 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心 5秒，速度為500g（或2000RPM；例如 eppendorf 5415）
6． （選擇步驟）加入 50微升用戶自備的 PCR 級(jí)礦物油（注意：參見注意事項(xiàng) 13）
7． 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng) PCR 反應(yīng)：
溫度（℃  時(shí)間  循環(huán)
95    2分鐘      1
95    1分鐘     30
45    1分鐘      30
70    1分鐘      30
70    5分鐘      1
8． 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳：產(chǎn)物為1.5kb左右
9． 如果繼續(xù)測序鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物（建議使用）
10．分別移出2微升用戶自備的測序反應(yīng)液到2個(gè)不同的新的1.5毫升離心管
11．加入1微升測序引物A（Reagent D）到其中一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
12．加入1微升測序引物B（Reagent E）到另一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
13．進(jìn)行后續(xù)的測序反應(yīng)
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
4． 在－20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
5． 建議樣品為純培養(yǎng)微生物的DNA；DNA提取應(yīng)確保高純度
6． 可以使用菌落直接檢測：用無菌槍頭點(diǎn)觸
7． 如果沒有擴(kuò)增條帶，可以直接測序，或詢問特殊引物設(shè)計(jì)服務(wù)
8． 可以直接使用純化的基因組DNA進(jìn)行測序
9． 可以將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，克隆到質(zhì)粒中，然后進(jìn)行測序
10．測序引物A（Reagent D）為上游引物，可以獲得500至1500的序列；引物序列為：
5－CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11．測序引物B（Reagent E）為下游引物，可以獲得0至500的序列；引物序列為：
5－GTATTACCGCGGCTGCTG－3
12．測序建議優(yōu)先使用測序引物B（Reagent E），其可變區(qū)域較為特征
13．根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
14．建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
15．本公司提供16SrDNA特異性引物設(shè)計(jì)服務(wù)

 

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