FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)是目前功能zui為強大全面的植物顯微熒光研究儀器。它由包含可擴展部件的增強顯微鏡、高分辨率CCD相機、激發(fā)光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應的控制單元和專用的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進行微藻、單個細胞、單個葉綠甚至基粒-基質類囊體片段進行Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線、QA再氧化等各種熒光成像動力學分析；還能通過激發(fā)光源組進行進行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進行GFP、DAPI等熒光蛋白、熒光素以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類特有熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團（例如，PSI和PSII及各種捕光色素復合體等）并進行深入分析。

FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)使熒光成像技術真正成為光合作用機理研究的探針，使科研工作者在細胞和亞細胞層次深入理解光合作用過程及該過程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統(tǒng)的工作機理提供了zui為有力的工具。

功能特點

內置現(xiàn)今葉綠素熒光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線、QA再氧化等，可獲得70余項參數(shù)。

配備20倍和40倍專用生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光。

激發(fā)光源組中包括紅光、藍光、綠光、白光、紫外光和遠紅光等，通過紅藍綠三色光還可以調出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物體中任何一種色素分子或發(fā)色團。

高靈敏度CCD鏡頭，時間分辨率zui高達50張每秒，可快速捕捉葉綠素熒光瞬變。

高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。

控溫系統(tǒng)可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進行測量，提高實驗精度，也可以進行高溫/低溫脅迫研究。

應用領域

顯微結構的植物光合生理研究

植物逆境研究

生物和非生物脅迫的研究

植物抗脅迫能力及易感性研究

突變體篩選及光合機理研究

藻類長勢與產量評估

藻類特有色素與光合作用關系

植物 微生物交互作用研究

植物 原生動物交互作用研究

基因工程與分子生物學研究

 測量樣品

植物活體切片

植物表皮

植物細胞

綠藻、藍藻等各種單細胞和多細胞微藻

葉綠體提取液

類囊體提取液

含有葉綠體的原生動物

 工作原理

FKM分析過程中，通過連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團的動態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經顯微鏡放大后進行熒光光譜分析和熒光動力學成像分析。SM 9000光譜儀通過光纖與顯微鏡連接，以進行激發(fā)熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機則用于熒光動力學成像分析。全部工作過程通過工作站和控制單元按照預先設定好的程序自動進行。測量過程中，可通過溫控模塊調控藻類、植物細胞等實驗樣品的溫度。蠕動泵可以實現(xiàn)培養(yǎng)藻類的連續(xù)測量。

儀器組成

1.增強顯微鏡

2.高分辨率CCD相機

3.激發(fā)光源組

4.SM 9000光譜儀

5.主控制單元

6.工作站及軟件

7.控溫模塊的控制單元

8.6位濾波輪

 技術參數(shù)

測量參數(shù)

F0，F(xiàn)0 ，F(xiàn)s，F(xiàn)m，F(xiàn)m ，F(xiàn)p，F(xiàn)tDn，F(xiàn)tLn，F(xiàn)v，NPQ_Dn，NPQ_Ln，Qp_Dn，Qp_Ln，qN，QY，QY_Ln，Rfd等五十多項參數(shù)

OJIP快速熒光曲線：F0、F300、Fj、Fi、Fm、Vj、Vi、Fv / Fm、M0、SM、SS、N、Phi_P0、Psi_0、Phi_E0、Phi_D0、Pi_Abs、ABS / RC、TR0/ RC、ET0/ RC、DI0/ RC等

QA再氧化曲線（選配）

熒光光譜圖

測量光：紅光、藍光、綠光、白光、紫外光

光化光：紅光、藍光、綠光、白光、紫外光，光強為6000-20000 mol(photons)/m2.s（與光質和放大倍數(shù)有關）

飽和光：紅光、藍光、綠光、白光、紫外光，光強為13000-80000 mol(photons)/m2.s（與光質和放大倍數(shù)有關）

透射光：白光、遠紅光

高分辨率CCD：像素可調，zui高達1392 1040像素，時間分辨率zui高達每秒50張

顯微鏡：Axio Imager M2

物鏡：20倍和40倍專用生物熒光物鏡

6位濾波輪：葉綠素熒光、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

SM9000光譜儀

入射狹縫：70 m 1400 m

光柵：平場型校正

光譜范圍：200-980nm

波長絕對精確度： 0.5nm

再現(xiàn)性： 0.1nm

溫度漂移： 0.01nm/K

溫度調控模塊：溫度調節(jié)范圍5℃-70℃，精確度0.1℃

蠕動泵（選配）：流速10-5600 l/min，用于藻類連續(xù)培養(yǎng)測量

FluorCam葉綠素熒光成像分析軟件，具Live（實況測試）、Protocol（實驗程序選擇）、Pre processing（成像預處理）、Result（成像分析結果）等菜單

Protocol實驗程序可自由編輯，用戶也可利用Protocol菜單中的向導程序模版自由創(chuàng)建新的實驗程序

成像預處理可以自動選區(qū)或手動選擇不同形狀、不同數(shù)量、不同位置的區(qū)域（Region of interest，ROI），成像分析結果包括高時間解析度熒光動態(tài)圖、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

數(shù)據(jù)分析具備 信號計算再平均 模式（算數(shù)平均值）和 信號平均再計算模式 ，在高信噪比的情況下選用 信號計算再平均 模式，在低信噪比的情況下選擇 信號平均再計算 模式以過濾掉噪音帶來的誤差

 葉綠素熒光與光譜分析結果

典型應用：
1. CLAIRE M. M. GACHON etc. Single-cell chlorophyll fluorescence kinetic microscopy of Pylaiella littoralis (Phaeophyceae) infected by Chytridium polysiphoniae (Chytridiomycota). Eur. J. Phycol., (2006), 41(4): 395 403

2. Hendrik Kupper etc. Reversible coupling of individual phycobiliprotein isoforms during state transitions in the cyanobacterium Trichodesmium analysed by single-cell fluorescence kinetic measurements. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, Volume 1787, Issue 3, March 2009, Pages 155-167

Fig. 1. 吸收光譜與熒光發(fā)射光譜：異構藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻紅蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后膽色素（PUB s）

Fig.2.各種色素蛋白對F0的貢獻、光譜及其隨時間的變化：異構藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻紅蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后膽色素（PUB s）

參考文獻：

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