【產品名稱】

通用名稱：人 ALDH2 基因檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

英文名稱：Human ALDH2 Gene Detection Kit

【包裝規(guī)格】 48 人份/盒

 

【檢驗原理】

 

本試劑盒采用聚合酶鏈式反應（PCR）結合 Taqman-MGB 探針技術，針對人類 ALDH2 基因 G1510A 多態(tài)

 

性位點，設計 1 套特異性引物和探針組合，一個反應體系中通過兩種不同通道檢測一個位點的基因多態(tài)性。利

 

用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

 

【主要組成成分】

 

序號

試劑名稱

主要組成成分

裝量規(guī)格

 

 

 

 

1

ALDH2 反應液

PCR 緩沖液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物、探針

1 管（960 l）

 

 

 

 

2

陽性對照

ALDH2 基因和內標的質?；旌弦?/p>

1 管（100 l）

 

 

 

 

3

陰性對照

1 TE  緩沖液

1 管（100 l）

 

 

 

 

【儲存條件及有效期】

 

試劑盒于-20℃ 5℃避光貯存，ALDH2 反應液反復凍融不宜超過 5 次，試劑開封后請于 2 個月內使用。

 

采用加冰或泡沫盒加冰密封進行運輸，運輸時間不宜超過 7 天；

 

試劑盒在正確儲存條件下有效期為 12 個月。生產日期和使用期限見產品標簽。

 

【適用儀器】

 

ABI7500 熒光定量 PCR 儀、BioRad CFX96 熒光定量 PCR 儀。

 

 

1

 

【樣本要求】

 

本試劑盒適用于從抗凝全血（不可用肝素）中提取人類基因組 DNA 進行檢測，-20℃保存，避免反復凍融。

 

樣本采集后應及時進行處理及檢測，可在 2℃～8℃可保存 7 天，置于 -20℃條件下可保存 1 年，避免反復凍融。

 

樣本運輸采用

加冰或泡沫盒加冰密封運輸。

 

【檢驗方法】

 

PCR 前處理

 

1.1 試劑準備（試劑準備室）：

 

1） 從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，各組分充分融解，渦旋混勻，快速離心 10 秒。

 

2） 核算當次實驗所需要的反應數（N），按照 20 l/孔的分裝量將 ALDH2 反應液分裝到 N 個 PCR 反應管內。

 

PCR 反應管通過傳遞窗轉移至樣本處理室，剩余試劑放回-20℃ 5℃冰箱避光保存。

 

N=  樣本數+陰性對照（1T）+陽性對照（1T）

 

1.2 樣本準備（樣本處理室）：

 

1） 樣本 DNA 提?。簠⒖妓徺I的商用基因組 DNA 提取試劑盒說明書進行操作。

 

推薦使用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit，DP318），用

 

于血液基因組 DNA 的提取。

 

2）加樣：將待測樣本的基因組 DNA、陰性對照、陽性對照分別加入已裝有 ALDH2 反應液的 PCR 反應管，加入量為 5 l/孔。蓋好 PCR 反應管蓋，記錄樣本加樣情況。瞬時低速離心，將 PCR 反應管轉移到核酸擴

 

增區(qū)進行上機檢測。若 PCR 反應管內加入模板后遇臨時情況不能立即上機，建議將加好模板的 PCR 反應

 

管置于 2~8℃暫時保存，并在 24 小時內盡快上機檢測。

 

PCR 擴增（PCR 擴增室）：

 

將準備好的PCR反應管放置在儀器樣本槽相應位置，并記錄放置順序。按表1設置儀器擴增相關參數：

 

表1：儀器擴增相關參數

 

 

階段

溫度

時間

循環(huán)數

 

 

 

 

 

PCR 反應條件

預變性

95℃

5 min

1 cycle

 

 

 

 

 

變性

95℃

10 s

40 cycles

 

 

 

 

 

退火、延伸及檢測熒光

60℃

45 s

 

 

 

 

 

 

 

檢測通道

ALDH2*G VIC 通道；ALDH2*A FAM 通道；內標基因 ROX 通道

 

 

 

 

 

*注：passive reference  和 quencher處均選擇 none 。

 

基線和閾值設定

 

反應結束后，根據擴增曲線，設定合適的基線（baseline）和熒光閾值（Threshold）。baseline 設為 3-15 （根據實際情況，baseline Cycler 可在一定范圍內變化），熒光閾值一般設定在擴增曲線指數增長期的拐點，得到不同通道的 Ct 值。

質量控制

 

1）陰性對照：FAM、VIC、ROX 均無擴增曲線或擴增曲線為輕微斜線，且 Ct 顯示為 Undet。

 

2）陽性對照：FAM、VIC、ROX 三個通道均有典型的 S 型擴增曲線且 Ct 值 30。

 

檢測結果的判定

 

 

2

 

在陰性對照和陽性對照均正常的情況下，結果判斷如下：

 

表2：結果判定

 

反應液

基因型

FAM通道

VIC通道

ROX通道

 

 

 

 

 

 

GG

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

 

 

純合野生

 

或無Ct值

 

 

 

 

 

 

ALDH2反應液

AG

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

雜合突變

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AA

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

 

 

純合突變

或無Ct值

 

 

 

 

 

 

 

 

待檢樣本內標 ROX 通道 Ct 值如果 38，則需對核酸提取物進行重復檢測，如仍 38，則需重新對樣本進

 

行提取或者重新采樣提取后進行檢測。

 

待檢樣本內標 ROX 通道 Ct 值 38，但 FAM 和 VIC 通道 Ct 值均 36，也需對核酸提取物進行重復檢測，

 

必要時需要重新提取或重新采樣。

 

【陽性判斷值】

 

根據臨床樣本檢測結果的數據，基于 ROC 曲線分析方法統計確定陽性判斷值，并通過大量樣本的檢測結

 

果對該陽性判斷值進行確認。

 

【檢驗結果的解釋】

 

本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及及治

 

療反應等情況綜合考慮。當檢測過程中不合理的樣本采集、轉運及處理導致的檢測樣本中被檢核酸濃度含量低

 

于zui低檢測限，會導致結果判讀的錯誤。實驗室環(huán)境污染，試劑污染，樣品交叉污染也會導致結果判讀錯誤；

 

試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，會出現與實際不符的結果。

 

【檢驗方法的局限性】

 

本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

 

模板 DNA 的質量可能受樣本來源、采集過程、運輸條件、樣本處理等因素影響，同時也受 DNA 提取方法、PCR 儀類型、操作環(huán)境以及當前分子生物學技術的局限性等的限制，可能導致出現假陽性和假陰性的檢測結果。

 

有關假陰性結果的可能性分析：

 

不合理的樣本采集、轉運及處理、樣本濃度過低均有可能導致假陰性結果。待測靶序列的變異或其它原因導致的序列改變可能會導致假陰性結果。

 

低于產品zui低檢測限的樣本無法檢出。

 

【產品性能指標】

 

本試劑盒zui低檢出限：1 102 copies/ l。

 

分析特異性：利用本試劑盒檢測與 ALDH2 基因檢測片段相似度高的人基因序列合成的陽性質粒，以及金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的基因組 DNA 均不會發(fā)生交叉。

 

準確性：采用企業(yè)陰陽性參考品對試劑盒進行檢測，其陰陽性符合率 100%。

 

 

3

 

精密度：本試劑盒的批內和批間的精密度參考品 Ct 值的變異系數均  5.0%。

 

臨床試驗：

 

【注意事項】

 

試劑盒使用前應仔細閱讀說明書。

 

本試劑盒為體外檢測試劑。操作人員應經過專業(yè)培訓并具有一定經驗。

 

整個實驗過程應分三個區(qū)域進行（試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR 擴增區(qū)），請嚴格分區(qū)操作；各區(qū)專用的儀器、設備、耗材和工作服均為專用，不得交叉使用；避免污染，實驗后請立即清潔工作臺。本產品使用前應在室溫充分融化，混勻并瞬時離心。

 

每次實驗應設置陰性對照和陽性對照。不同批號的試劑請勿混用，于有效期內使用試劑盒。

 

凍存的 DNA 樣本，加樣前應在室溫充分融化、混勻并瞬時離心后使用。

 

反應液分裝時盡量避免產生氣泡，放入擴增儀前應檢查各 PCR 反應管是否蓋緊，避免對儀器及環(huán)境的污染。

 

本試劑盒所涉及的待測樣本應視為具有傳染性物質，操作和處理均需符合衛(wèi)生部《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》相關要求。