不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳色譜儀是在電泳體系中采用兩種以上的緩沖液成分、pH和凝膠孔徑，其中不連續(xù)盤狀凝膠電泳zui為常用。在不連續(xù)盤狀凝膠電泳中存在樣品的濃縮效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)三大效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。

一、濃縮效應(yīng)：

  1、凝膠層的不連續(xù)性：

（1）樣品膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。樣品預(yù)先加在其中，起防止對(duì)流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中。目前電泳一般不制作此膠。

（2）濃縮膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。起防止對(duì)流的作用，樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面處濃縮成薄層。

（3）分離膠：為小孔膠，采用化學(xué)聚合法制備。樣品在其中進(jìn)行電泳和分子篩分離，起防止對(duì)流的作用。蛋白質(zhì)分子在大孔凝膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔凝膠時(shí)受到的阻力大，移動(dòng)速度減慢。由于凝膠層的不連續(xù)性，在濃縮膠與分離膠的界面處使樣品濃縮，區(qū)帶變窄。

  2、緩沖液離子組成的不連續(xù)性：

  在電場(chǎng)中如有兩種電荷符號(hào)相同的離子向同一方向移動(dòng)，其遷移率不同，兩種離子若能形成界面，則跑在前面的離子稱為快離子（前導(dǎo)離子），跑在后面的離子稱為慢離子（尾隨離子）。為了使樣品達(dá)到濃縮的目的，需在緩沖液中加入有效遷移率不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖液中組成不連續(xù)的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。為了保持溶液的電中性和一定的pH值，需加入一種與快、慢離子電荷符號(hào)相反的離子，稱為緩沖配對(duì)離子，使緩沖配對(duì)離子分布于全部緩沖液中，即三層凝膠緩沖液和電極緩沖液中。

  如分離蛋白質(zhì)時(shí)，通常采用氯離子（Clˉ）為快離子，甘氨酸根離子（(NH2CH2COOˉ）為慢離子，三羥甲基氨基甲烷（Tris+）為緩沖配對(duì)離子。

  電泳開始前，慢離子位于兩個(gè)電極槽中，快離子分布于三層凝膠中，樣品在樣品膠中，緩沖配對(duì)離子分布于全部緩沖液中。電泳進(jìn)行時(shí)，快離子與慢離子的界面向下移動(dòng)。由于選擇適當(dāng)?shù)膒H值緩沖液，使蛋白質(zhì)的有效遷移率介于快、慢離子之間，而濃縮成為極窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品到達(dá)濃縮膠與分離膠的界面處時(shí)，離子界面繼續(xù)前進(jìn)，蛋白質(zhì)被留在后面，然后被分成多個(gè)區(qū)帶。

  3、緩沖液pH的不連續(xù)性：

  在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子比所有被分離樣品的有效遷移率都低，使樣品夾在快離子與慢離子的界面之間被濃縮。而在分離膠中，慢離子的有效遷移率比所有被分離樣品的有效遷移率都高，使樣品不再受離子界面的影響。

  電極緩沖液pH = 8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小。濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大。蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于快、慢離子之間。電泳開始后，氯離子跑得zui快，留下一低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度，使甘氨酸根離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間被壓縮。

  4、電位梯度的不連續(xù)性：

  在不連續(xù)體系中，電位梯度的差異是自然形成的。電泳開始后，由于快離子的遷移率zui大，會(huì)很快超過蛋白質(zhì)，在快離子的后邊形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。由于電導(dǎo)與電位梯度成反比，低電導(dǎo)區(qū)的電位梯度較高。高電位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動(dòng)。當(dāng)快離子、慢離子和蛋白質(zhì)的有效遷移率與電位梯度的乘積分別相等時(shí)，則三種離子的移動(dòng)速度相同?？臁⒙x子的移動(dòng)速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，在快、慢離子之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向正極移動(dòng)的界面，即在高、低電位梯度區(qū)之間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面，由于蛋白質(zhì)的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此就聚焦在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮成一個(gè)狹小的中間層。

二、分子篩效應(yīng)：

  離子界面到達(dá)濃縮膠與分離膠的界面處時(shí)，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，有效遷移率超過蛋白質(zhì)，隨之高電位梯度消失，蛋白質(zhì)在均一的電位梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的相對(duì)分子量和構(gòu)象不同時(shí)，通過分離膠所受到的阻力不同，因遷移率不同而被分開。凝膠這種分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力，這種現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)。

三、電荷效應(yīng)：

  蛋白質(zhì)在濃縮膠與分離膠的界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)帶，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多的，移動(dòng)速度快，反之則慢。因此各蛋白質(zhì)以一定的順序排列成多個(gè)圓盤狀。

  綜上所述，樣品的濃縮效應(yīng)是在濃縮膠中進(jìn)行，分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)主要是在分離膠中進(jìn)行。在蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，由于在濃縮膠中的慢離子跑到蛋白質(zhì)前面，高電位梯度消失，使蛋白質(zhì)進(jìn)入均一的電位梯度和pH的分離膠中。此時(shí)，又由于分離膠的孔徑小，各蛋白質(zhì)因分子大小和形狀不同而被阻滯的程度不同，使一些即使是凈電荷相同的蛋白質(zhì)分子也因分子篩效應(yīng)不同而得到分離。

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