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反向PCR (inverse-PCR)實(shí)驗(yàn)步驟_91化工儀器網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-09-02  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):997
核心提示:nverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽(yáng)性太多,而Inverse-PCR一般只要有特異條帶,基本上就是目的片段?;静襟E如下:1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。并在T-DNA的邊界(左邊界、右邊界均可)和酶切位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物P1、P2;b. 回收DNA,T4連接酶連接,使酶切后的DNA片段環(huán)化;c. 回收連接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可

nverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽(yáng)性太多,而Inverse-PCR一般只要有特異條帶,基本上就是目的片段。

基本步驟如下:

1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。

a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。并在T-DNA的邊界(左邊界、右邊界均可)和酶切位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物P1、P2;

b. 回收DNA,T4連接酶連接,使酶切后的DNA片段環(huán)化;

c. 回收連接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可擴(kuò)增到兩端為T-DNA插入序列,中間為側(cè)翼序列的片段。

2、限制性內(nèi)切酶消化:選擇合適的限制性內(nèi)切酶,基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前,應(yīng)對(duì)基因組DNA定量。

根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點(diǎn)EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位點(diǎn)上游附近設(shè)計(jì)引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA,酶切體系如下:

Buffer for EcoR I 

2 l

Genomic DNA 

3 l

EcoR I 

0.5 l (10u/ l)

ddH2O 

14.5 l

 

20 l 

37度 過一夜,電泳檢測(cè)酶切效果。

3、回收DNA

① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中,用ddH2O洗滌干凈,并稀釋到250 l;

② 加入等體積的酚和氯仿(V:V=1:1),渦旋混勻,室溫靜置1min;

③ zui大速度(13, 000 rpm)離心1min;

④ 將上清移到另一管中,加入等體積的氯仿,渦旋混勻,室溫靜置1min;

⑤ zui大速度(13, 000 rpm)離心2min;

 


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