亚洲欧美日本韩国_久久久久亚洲AV片无码V_亚洲AV片不卡无码一_H漫全彩纯肉无码网站

 
 
當(dāng)前位置: 首頁(yè) » 新聞資訊 » 廠商 » 正文

里氏木霉分泌型表達(dá)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)討論-公司動(dòng)態(tài)-舜冉(上海)生物科技有限公司

分享到:
放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-09-02  來(lái)源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):941
核心提示:里氏木霉是一種具有巨大蛋白分泌潛力的微生物,并且一直以來(lái)被認(rèn)為是安全的工業(yè)生產(chǎn)菌株,在同源蛋白表達(dá)方面,該表達(dá)系統(tǒng)已滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求,且質(zhì)量?jī)?yōu)異,產(chǎn)量巨大。但在異源蛋白表達(dá)方面,除僅有的數(shù)種異源蛋白表達(dá)量滿足工業(yè)化生產(chǎn)外,該表達(dá)系統(tǒng)尚不足以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。隨著近年來(lái)里氏木霉基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的相關(guān)研究取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展,限制異源表達(dá)的瓶頸可能隨時(shí)被打破,另一個(gè)類似于酵母表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)即將產(chǎn)生。本研究構(gòu)建的里氏木霉外源基因表達(dá)載體 Ppth15,使用了里氏木霉zui強(qiáng)效的啟動(dòng)子 Pcbh1

里氏木霉是一種具有巨大蛋白分泌潛力的微生物,并且一直以來(lái)被認(rèn)為是安全的工業(yè)生產(chǎn)菌株,在同源蛋白表達(dá)方面,該表達(dá)系統(tǒng)已滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求,且質(zhì)量?jī)?yōu)異,產(chǎn)量巨大。但在異源蛋白表達(dá)方面,除僅有的數(shù)種異源蛋白表達(dá)量滿足工業(yè)化生產(chǎn)外,該表達(dá)系統(tǒng)尚不足以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。隨著近年來(lái)里氏木霉基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的相關(guān)研究取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展,限制異源表達(dá)的瓶頸可能隨時(shí)被打破,另一個(gè)類似于酵母表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)即將產(chǎn)生。

本研究構(gòu)建的里氏木霉外源基因表達(dá)載體 Ppth15,使用了里氏木霉zui強(qiáng)效的啟動(dòng)子 Pcbh1,并引入 CBH1 自身信號(hào)肽來(lái)介導(dǎo)目的蛋白的分泌性表達(dá)。通過(guò)引物設(shè)計(jì),在 Pcbh1 上游引入 Sal I-Not I 2 個(gè)酶切位點(diǎn),其目的是為后續(xù)實(shí)驗(yàn),如啟動(dòng)子的替換、基因改造等預(yù)留空間;在啟動(dòng)子下游使用 Spe I-EcoR Ⅴ-Afl II 3 個(gè)常用酶切位點(diǎn)構(gòu)成了多克隆位點(diǎn),后續(xù)工作還可以在這個(gè)位點(diǎn)插入多種不同的酶切位點(diǎn)。根據(jù)坎貝爾機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)使用里氏木霉 CBH1 的啟動(dòng)子 Pcbh1 與終止子 Tcbh1 形成兩段同源性序列,以達(dá)到將目的基因表達(dá)框與里氏木霉 CBH1 表達(dá)框進(jìn)行定向整合及替換的目的。

表達(dá)載體 Ppth15 上搭載了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (HygB),啟動(dòng) HygB 表達(dá)的是三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子(PgpdA),PgpdA 是組成型啟動(dòng)子,故當(dāng) HygB 整合入里氏木霉基因組后,它的翻譯和表達(dá)不受培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的影響,由此可使陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選工作簡(jiǎn)單化。本實(shí)驗(yàn)成功地在里氏木霉中表達(dá)了綠色熒光蛋白,通過(guò)熒光顯微鏡可以清楚地觀察到菌絲的頂端、隔膜及培養(yǎng)基中有大量熒光,這與絲狀真菌胞外蛋白主要通過(guò)菌絲頂端分泌的論斷一致。

但我們還發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象,在橫隔附近的細(xì)胞壁上,也可以看到有 eGFP 的堆積,分析原因可能是當(dāng)橫隔小孔轉(zhuǎn)運(yùn) eGFP 的能力飽和后,造成 eGFP 的堆積,誘導(dǎo)宿主激活另一種蛋白分泌機(jī)制,同樣的現(xiàn)象在黑曲霉表達(dá)中也有報(bào)道。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性菌株的發(fā)酵上清濃縮后進(jìn)行 SDS-PAGE 分析,可以在預(yù)計(jì)大小位置觀察到條帶,這證明了綠色熒光蛋白被成功表達(dá)并分泌到了胞外。不可否認(rèn)的是,在發(fā)酵液未經(jīng)濃縮處理前,eGFP 的 SDS-PAGE 條帶是不清晰的,說(shuō)明表達(dá)量尚未達(dá)到zui大化、發(fā)酵條件也并非zui優(yōu)。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以在發(fā)酵條件、密碼子優(yōu)化,啟動(dòng)子修飾及選用蛋白酶缺陷菌株上進(jìn)行綜合優(yōu)化、由此來(lái)提高外源蛋白的表達(dá)量。里氏木霉外源基因表達(dá)載體 Ppth15 的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究里氏木霉表達(dá)其他外源蛋白提供了有效的載體工具,綠色熒光蛋白的表達(dá)揭示了外源蛋白在里氏木霉中分泌的過(guò)程和特點(diǎn),為里氏木霉高產(chǎn)工程菌株的培育提供了研究方向。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 汪天虹, 吳靜, 鄒玉霞. 瑞氏木霉分子生物學(xué)研究進(jìn)展 [J]. 菌物系統(tǒng), 2000, 19(1): 147-152.

[2] Guangtao Z, Hartl L, Schuster A, et al. Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina[J]. Journal of Biotechnology, 2009, 139(2): 146-151.

[3] Harkki A, Mantyla A, Penttila M, et al. Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1991, 13(3): 227-233.

[4] Durand H, Clanet M, Tiraby GER. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1988, 10(6): 341-346.

[5] Ward OP. Production of recombinant proteins by filamentous fungi[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(5): 1119-1139.

[6] Diener SE, Chellappan MK, Mitchell TK, et al. Insight into Trichoderma reesei s genome content, organization and evolution revealed through BAC library characterization[J]. Fungal Genetics and Biology, 2004, 41(12): 1077-1087.

[7] Salovuori I, Makarow M, Rauvala H, et al. Low molecular weight high-mannose type glycans in a secreted protein of the filamentous fungus Trichoderma reesei[J]. Nature Biotechnology, 1987, 5(2): 152-156.

[8] 鐘耀華, 王曉利, 汪天虹. 絲狀真菌表達(dá)異源蛋白研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(4): 531-540.

[9] Nevalainen KMH, Te?O VSJ, Bergquist PL. Heterologous protein expression in filamentous fungi[J]. Trends in Biotechnology, 2005, 23(9): 468-474.

[10] van den Hombergh JP, van de Vondervoort PJ, Fraissinet-Tachet L, et al. Aspergillus as a host for heterologous protein production: the problem of proteases[J]. Trends in Biotechnology, 1997, 15(7): 256-263.

[11] Punt PJ, van Biezen N, Conesa A, et al. Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production[J]. Trends in Biotechnology, 2002, 20(5): 200-206.

[12] Wang LP, Ridgway D, Gu TY, et al. Bioprocessing strategies to improve heterologous protein production in filamentous fungal fermentations[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(2): 115-129.

[13] 劉倜. 多拷貝策略構(gòu)建瑞氏木霉外源基因系列表達(dá)載體 [D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2005, 58.

[14] Te?O VSJ, Cziferszky AE, Bergquist PL, et al. Codon optimization of xylanase gene xynB from the thermophilic bacterium Dictyoglomus thermophilum for expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei[J]. FEMS Microbiology Letters, 2000, 190(1): 13-19.

[15] 汪天虹, 劉倜, 劉世利, 等. 瑞氏木霉外源基因表達(dá)系統(tǒng)中受體菌株的改造 [J]. 菌物學(xué)報(bào) , 2004, 23(2): 248-254.

[16] Zhong YH, Liu X, Xiao P, et al. expression and secretion of the human erythropoietin using an optimized cbh1 promoter and the native CBH I signal sequence in the industrial fungus Trichoderma reesei[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011, 165(5/6): 1169-1177.

[17] Conesa A, Punt PJ, van Luijk N, et al. The secretion pathway in filamentous fungi: a biotechnological view[J]. Fungal Genetics and Biology, 2001, 33(3): 155-171.

[18] Shoji JY, Arioka M, Kitamoto K. Dissecting cellular components of the secretory pathway in filamentous fungi: insights into their application for protein production[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(1): 7-14.

[19] Valkonen M, Penttila M, Saloheimo M. The ire1 and ptc2 genes involved in the unfolded protein response pathway in the filamentous fungus Trichoderma reesei[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2004, 272(4): 443-451.

[20] Saloheimo M, Lund M, Penttil AME. The protein disulphide isomerase gene of the fungus Trichoderma reesei is induced by endoplasmic reticulum stress and regulated by the carbon source[J]. Molecular and General Genetics MGG, 1999, 262(1): 34-45.

[21] Hampton RY. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2002, 14(4): 476-482.

[22] Penttila M, Nevalainen H, Ratto M, et al. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei[J]. Gene, 1987, 61(2): 155-164.

[23] 鄭紅玉, 黃毓茂, 余希堯, 等. 黑曲霉分泌表達(dá)載體的構(gòu)建以及綠色熒光蛋白的表達(dá)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 34(4): 574-579.

[24] Vosman B, Kooistra J, Olijve J, et al. Integration of vector-containing Bacillus subtilis chromosomal DNA by a Campbell-like mechanism[J]. Molecular and General Genetics MGG, 1986, 204(3): 524-531.

[25] Gordon CL, Khalaj V, Ram AF, et al. Glucoamylase: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger[J]. Microbiology, 2000, 146(Pt2): 415-426.

上一篇:細(xì)胞,該如何度過(guò)夏天呢? 下一篇:PD- 1細(xì)胞可抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能返回列表 打印關(guān)閉
*驗(yàn)證碼:  = 請(qǐng)輸入計(jì)算結(jié)果(填寫阿拉伯?dāng)?shù)字),如:三加四=7
 
關(guān)鍵詞: 表達(dá) 里氏 蛋白 菌株 基因
 
打賞
[ 新聞資訊搜索 ]  [ 加入收藏 ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 違規(guī)舉報(bào) ]  [ 關(guān)閉窗口 ]
免責(zé)聲明:
本網(wǎng)站部分內(nèi)容來(lái)源于合作媒體、企業(yè)機(jī)構(gòu)、網(wǎng)友提供和互聯(lián)網(wǎng)的公開資料等,僅供參考。本網(wǎng)站對(duì)站內(nèi)所有資訊的內(nèi)容、觀點(diǎn)保持中立,不對(duì)內(nèi)容的準(zhǔn)確性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保證。如果有侵權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們,我們將在收到通知后第一時(shí)間妥善處理該部分內(nèi)容。
 

里氏木霉分泌型表達(dá)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)討論-公司動(dòng)態(tài)-舜冉(上海)生物科技有限公司二維碼

掃掃二維碼用手機(jī)關(guān)注本條新聞報(bào)道也可關(guān)注本站官方微信賬號(hào):"xxxxx",每日獲得互聯(lián)網(wǎng)最前沿資訊,熱點(diǎn)產(chǎn)品深度分析!
 

 
0相關(guān)評(píng)論

 
国产亚洲精品久久777777| 激情综合一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻门事件 | 比较有韵味的熟妇无码| 国产又黄又爽胸又大免费视频| 国产成人乱色伦区| 久久精品国产亚洲av电影网| 人妻中文字幕乱人伦在线| 一区二区国产精品精华液| 亚洲 高清 成人 动漫| 熟女少妇在线视频播放| 亚洲视频在线观看| 岳丰满多毛的大隂户| 无码人妻精品一区二区蜜桃百度| 色婷婷日日躁夜夜躁| 人人玩人人添人人澡| 国产精品免费精品自在线观看| 内射人妻视频国内| 成年性生交大片免费看| 色综合天天综合欧美综合| 免费三级网站| 三年片在线视频中国| 色94色欧美sute亚洲线路二| 99偷拍视频精品一区二区| 国产精品无码av天天爽| 97高清国语自产拍| 女人张开腿让男桶喷水高潮 | 婷婷丁香五月激情综合| 国产欧美日韩va另类在线播放| 100禁毛片免费40分钟视频| 亚洲av无码之国产精品| 国产麻豆天美果冻无码视频| 成人天堂资源www在线| 丰满少妇愉情中文字幕18禁片| 国产成人亚洲日韩欧美| 久久老子午夜精品无码怎么打| 久久久精品456亚洲影院| 亚洲精品字幕| 俺来也俺去啦最新在线| 久久精品国产亚洲av高清漫画| 131美女爱做视频|