骨關節(jié)炎（OA）是常見的關節(jié)疾病之一，是關節(jié)運動過程中慢性疼痛導致殘疾的主要原因。然而，骨關節(jié)炎的發(fā)病機制是復雜的，目前仍知之甚少。因此迫切需要開發(fā)治療骨關節(jié)炎安全有效的策略。通常，骨關節(jié)炎的特征是軟骨退化、軟骨細胞凋亡和滑膜慢性炎癥。腫瘤壞死因子- （TNF- ）是最重要的促炎細胞因子之一，參與包括骨關節(jié)炎在內(nèi)的各種慢性炎癥疾病。TNF- 的過度表達促進炎癥，炎癥通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的產(chǎn)生，特別是MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生，在OA的發(fā)生和進展中起著至關重要的作用。

MMP-3和MMP-13負責II型膠原的降解。MMP還抑制SRY相關高遷移率族蛋白9（SOX-9）的表達，SOX-9是一種廣泛公認的參與軟骨形成的轉錄因子。因此，TNF- 是治療骨關節(jié)炎常用的治療靶點。干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）-1是骨關節(jié)炎中調(diào)節(jié)MMP轉錄的另一個關鍵因子。IRF-1的上調(diào)增強了MMP-3和MMP-13的表達，從而促進軟骨降解。此外，據(jù)報道氧化應激是軟骨細胞凋亡的效應物?；钚匝醯倪^量產(chǎn)生誘導JAK2/STAT1途徑的激活，該途徑調(diào)節(jié)細胞因子、酶和其他與骨關節(jié)炎相關因子的表達。

G蛋白偶聯(lián)受體17（GPR17）是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族的一個孤兒受體。研究表明，GPR17在肺纖維化小鼠模型中可以介導促炎細胞因子如TNF- 的表達。這表明GPR17的阻斷可能是治療炎癥相關疾病的一種有前途的方法。然而，GPR17在OA中的生理功能還沒有研究。有報道稱普侖司特對GPR17信號有抑制作用，被認為是一種合成的GPR17抑制劑，這為研究其在不同細胞中的作用提供了有力的工具。本研究的目的是研究普侖司特是否能通過阻斷GPR17的激活而對II型膠原的降解起到保護作用。

 

 

基本信息

題目：

Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF- -induced loss of type II collagen in ATDC5 cells

期刊：International Immunopharmacology

影響因子：3.943

PMID：32805694 

通訊作者：楊廣勇

作者單位：溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院

索萊寶合作產(chǎn)品：

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

Mouse MMP-13 ELISA KIT

SEKM-0172  

摘 要 

骨關節(jié)炎（OA）是一種常見的關節(jié)疾病，影響著全世界數(shù)百萬的老年人。然而，OA的機制是復雜的，人們對其了解甚少。因此，安全有效的治療策略還有待發(fā)展。G蛋白偶聯(lián)受體17（GPR17）是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的孤兒受體。GPR17已成為治療腦部疾病炎癥的靶點。在這項研究中，作者證明了GPR17在ATDC5細胞中表達，并且在腫瘤壞死因子- （TNF- ）暴露時增加。作者還發(fā)現(xiàn)普侖司特拮抗GPR17可以通過下調(diào)細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平和增加超氧化物歧化酶（SOD）對TNF- 的活性而顯著抑制氧化應激。有趣的是，普侖司特治療可防止TNF- 誘導的II型膠原減少。此外，siRNA敲除GPR17可改善TNF- 誘導的II型膠原的降低，這表明GPR17在介導II型膠原損傷中具有重要的作用。普侖司特阻斷GPR17，可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）的表達，MMP可導致II型膠原的降解。普侖司特還可以抑制JAK2/STAT1/IRF-1信號通路的激活，從而抑制促炎細胞因子和酶的表達。此外，普侖司特挽救了TNF- 誘導的SOX-9表達降低?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明GPR17可能是治療OA的潛在靶點。 

研究內(nèi)容及結果 

1.GPR17在ATDC5細胞中表達

作者首先評估GPR17是否在ATDC5細胞中表達。為了評價GPR17的表達情況，作者以G422細胞作為陽性對照，因為GPR17在G422細胞中表達較高。圖1A的RT-PCR分析結果顯示，與G422細胞中的表達水平相比，ATDC5細胞中GPR17在基因水平上有良好的表達。同樣，通過Western blot分析，作者證實GPR17在ATDC5細胞中在蛋白水平上高度表達，如圖1B所示。

圖1

2.TNF- 增加ATDC5細胞中GPR17的表達

接下來，作者測定了TNF- 對ARDC5細胞中GPR17表達的影響。圖2A中的結果顯示，與基線相比，三種劑量的TNF- 將GPR17的mRNA水平分別增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。圖2B顯示，經(jīng)TNF- 處理后，GPR17的蛋白質(zhì)水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍。總的來說，TNF- 在基因和蛋白質(zhì)水平上都表現(xiàn)出很強的促進GPR17表達的能力。

圖2

3.普侖司特可降低TNF- 誘導的ATDC5細胞氧化應激

普侖司特的分子結構如圖3A所示。為了確定普侖司特對TNF- 誘導的氧化應激的影響，作者測定了ROS和SOD的水平。如圖3B所示，TNF- 誘導細胞內(nèi)ROS水平增加了3.3倍，用5 M和10 M普侖司特處理后，細胞內(nèi)ROS水平僅增加到2.4倍和1.6倍。同時，TNF- 將SOD活性降至15.6U/100mg蛋白質(zhì)，而基線時為31.1U/100mg蛋白質(zhì)。然而，5 M普侖司特將SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白質(zhì)，10 M普侖司特進一步將其提高到29.8U/100mg蛋白質(zhì)（圖3C），接近基線水平。普侖司特表現(xiàn)出劑量依賴性的抗氧化作用。

圖3

4.普侖司特抑制TNF- 誘導的II型膠原減少

抑制細胞中II型膠原降解是預防和治療OA的普遍靶點。這篇研究中，作者試圖確定普侖司特對TNF- 誘導的II型膠原減少的影響。Col2a1的mRNA水平在單獨暴露于TNF- 時降低到45%，而用5 M和10 M普侖司特處理時，Col2a1的mRNA水平分別上升到68%和92%，結果如圖4A所示。圖4B顯示，與上述相同劑量的普侖司特可使Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量提高到71%和94%，而TNF- 處理組的Ⅱ型膠原的蛋白質(zhì)含量為51%。

圖4

5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF- 誘導的II型膠原減少

普侖司特作為GPR17的公認拮抗劑，其對ATDC5細胞的保護作用可能是通過阻斷GPR17的表達而實現(xiàn)的。為了驗證這一理論，作者使用siRNA沉默GPR17的表達（圖5A）。圖5B和5C的結果顯示，GPR17的敲除對TNF- 誘導的Col2a1基因和II型膠原蛋白的減少具有保護作用。這些發(fā)現(xiàn)表明GPR17的表達介導II型膠原的減少。

在補充材料中，作者檢測了普侖司特對GPR17表達的影響。結果表明，普侖司特在基礎條件下和TNF- 處理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表達。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)GPR17的過表達消除了普侖司特對Col2a1基因表達和II型膠原蛋白表達的保護作用。這些研究結果表明，普侖司特對TNF- 誘導的II型膠原減少中的有益作用是通過抑制GPR17介導的。

圖5

6.普侖司特在ATDC5細胞中可恢復TNF-ɑ誘導的SOX-9的減少

SOX-9是一種在軟骨形成中起重要作用的轉錄因子。SOX-9的表達對抑制TNF- 誘導的II型膠原降解具有重要作用。如圖6A中所示，TNF- 誘導SOX-9的mRNA水平降低52%，分別用5 M和10 M普侖司特處理后可增加到73%和95%。與單獨TNF- 處理組相比（55%），與上述相同劑量的普侖司特將SOX-9的蛋白質(zhì)水平分別提高到76%和97%（圖6B）。

圖6

7.普侖司特在ATDC5細胞中可降低TNF-ɑ誘導的MMP-3和MMP-13的表達

由于MMP-3和MMP-13被認為是參與II型膠原降解的最重要的酶，因此作者確定了普侖司特對這兩種蛋白表達的影響。圖7A顯示，TNF- 刺激后，MMP-3和MMP-13的mRNA水平分別增加了3.2倍和3.9倍。然而，5 M的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到2.1倍和2.3倍，10 M的普侖司特將MMP-3和MMP-13 mRNA水平分別降低到1.5倍和1.7倍。與之一致的是，圖7B的結果顯示，經(jīng)TNF- 處理后，MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL，高于基線時的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同時，5和10 M普侖司特將MMP-3的蛋白水平分別降低到265.7和185.6pg/mL，MMP-13的蛋白水平分別降低到466.9和327.5pg/mL。

圖7

8.普侖司特在ATDC5細胞中可抑制TNF-ɑ誘導的IRF-1的表達

MMP-3和MMP-13受IRF-1的轉錄調(diào)控。在這里，作者測定了普侖司特對TNF- 誘導的IRF-1表達的影響。圖8A的結果顯示，TNF- 誘導IRF-1在基因水平上的表達增加了3.2倍，而用5 M和10 M普侖司特處理后，IRF-1的表達分別下降到2.1和1.4倍。如預期一致，圖8B所示，兩劑量的普侖司特分別將IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍，相比之下，單獨使用TNF- 處理的IRF-1蛋白水平為2.9倍。最后，圖8C的免疫染色結果顯示，單獨TNF- 處理后，IRF-1的表達明顯增加到3.2倍。然而，5 M普侖司特可使IRF-1水平降低到2.2倍，10 M普侖司特可使IRF-1水平進一步降低到1.6倍。

圖8

9.普侖司特抑制TNF- 誘導的JAK2/STAT1通路的激活

JAK2/STAT1通路已被證明在OA中調(diào)節(jié)細胞因子和MMPs的產(chǎn)生中發(fā)揮關鍵作用。這項研究中，作者確定了普侖司特阻斷GPR17是否會抑制JAK2/STAT1通路的激活。如圖9所示，Western Blot分析顯示，與基線相比，TNF- 處理顯著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平，約為2.7倍和2.9倍。而5 M普侖司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表達，分別為2.1倍和1.9倍。此外，10 M普侖司特進一步將這些值降低到1.5和1.4倍。普侖司特對TNF- 誘導的JAK2/STAT1通路的激活具有較強的抑制作用。

圖9

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結 論

綜上所述，作者的研究提供了新的證據(jù)，表明普侖司特通過阻斷GPR17的表達，對TNF- 誘導的II型膠原降解具有保護作用。作者的發(fā)現(xiàn)提示GPR17可能是治療OA的一個潛在靶點。然而，還需要更多的試驗來進一步研究GPR17及其拮抗劑對骨關節(jié)炎進展和發(fā)展的影響。

 

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