通過細胞融合技術(shù)將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，所產(chǎn)生的融合細胞既具有親本骨髓瘤細胞的無限繁殖的生物學特性，又具有另一親本B淋巴細胞合成、分泌特異性抗體的能力。應(yīng)用此技術(shù)從一個抗體分泌性B細胞雜交瘤分裂增殖，形成一個大的細胞克隆。由B細胞雜交瘤細胞克隆產(chǎn)生的只識別抗原分子上某一個抗原決定簇的純抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強、利于實驗標準化即可大量生產(chǎn)供應(yīng)等特點。

  在單克隆抗體制備中，雖然除小鼠外其它動物也可用于制備雜交瘤，但本書以小鼠為例來說明有關(guān)技術(shù)，同樣的技術(shù)也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對特殊動物之間或與人細胞的融合，也有簡要說明。

單克隆抗體的制備是一個復(fù)雜、精細的工藝過程。為對全過程有一個概括的了解，先用表1 列出mAbs制備過程中的各個階段。一般將全過程分為三個階段：（1）免疫小鼠；（2）建立篩選方法和程序；及（3）雜交瘤生成。 

表1  雜交瘤細胞生成的各個階段和所需時間

動物免

疫階段

初始免疫

兩周

一個月到一年

10天

強化免疫

血清測試

方法建

立階段

篩選方法的建立與測試

zui少

兩周

大約一個月

zui后一次強化免疫

三

天

雜交瘤細胞生成階段

大約

一周

細胞融合

大約一個月

篩選陽性克隆

 陽性克隆擴增及凍存

大約

一周

單細胞的克隆生長

篩  選

部分陽性細胞擴增*

大部凍存（保留zui后所得的雜交瘤細胞）

 *得到擴增的陽性雜交瘤細胞后，可從其培養(yǎng)液中收集含單克隆抗體的上清液，進行鑒定（其抗體含量為10-50 g/ml）；

  *雜交瘤細胞也可進行小鼠腹腔注射，以產(chǎn)生Mab含量高的腹水（其抗體含量為1-10mg/ml）。 

  以上每一階段都有可能迅速順利完成，但各階段也都有其本身的問題，需在實驗開始前予以充分考慮，以免影響全局。以下分別進行討論。動物在注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的體液免疫應(yīng)答，同時又已建立合用的篩選方法，并通過血清對所建立篩選方法進行評價、確定方法后，才可開始雜交瘤細胞的制備。其過程大致為：在細胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動物；將從免疫動物得到的分泌抗體的細胞與骨髓瘤細胞相混，進行細胞融合（有效的細胞融合約可得1/105存活的雜交細胞）；其后，將融合細胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。在細胞融合后一周，即可對雜交瘤進行測試，從陽性培養(yǎng)孔所取的細胞先增殖，然后，進行克隆化（即單克隆生長），雜交瘤的生成與克隆需要時間，很少的實例只需要兩個月，有的甚至要一年時間。因制備mAbs 過程中的每一步都對其后各步影響很大，因此均需注意選擇zui適宜的條件，如：

1）要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；

2）根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對抗體得要求等，計劃及建立免疫的途徑和方式；

3）選定篩選的方法：抗體篩選的測試方法必須簡單、可重復(fù)、特異，并可適用于mAb的zui終使用（即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗等中的應(yīng)用）；

4）要確定細胞培養(yǎng)的條件；

5）進行細胞融合的方式：包括雜交方法和細胞的選擇，和克隆的方式（限制性稀釋或軟膠法）等。

  典型的單克隆抗體的制備過程為：

1． *次對每一小鼠注射500 l抗原與完全福氏佐劑1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗體的實際需用量見表2）；

2．14天后，再次注射，但改用抗原與不完全福氏佐劑混合液；

3．第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經(jīng)PBS 1：5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對照，用點雜交（Dot blot）法進行測定；

4．第35天，所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不完全福氏佐劑混合液；

5．第45天，取尾靜脈血，用點雜交法再次檢測。所有血清樣品均通過與在體同位素標記的抗原進行免疫沉淀法檢測；

6．第56天，對免疫應(yīng)答zui好的小鼠再靜脈注射100 l 及腹腔注視100 l不完全福氏佐劑抗原混合液，而對所有其余小鼠僅腹腔注射不完全福氏佐劑抗原混合液；

7．第59天由免疫應(yīng)答zui好的小鼠取脾細胞進行細胞融合；

8．第66天，開始艱巨的工作，尋找*個陽性克隆的篩選。

*具體免疫抗原用量參見表2。 

表2 抗原的參考用量

抗原類型

舉  例

初次免疫及加強免疫

zui后加強免疫

抗原的劑量與方式

抗原的劑量與方式

可溶性蛋白

酶、多肽與載體蛋白

復(fù)合物、免疫復(fù)合物

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

顆粒性蛋白

已殺死的病毒或酵母

或細菌，結(jié)構(gòu)蛋白

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

不溶性蛋白

細菌包含體的產(chǎn)物

與固相小球結(jié)合的

經(jīng)免疫純化蛋白

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，ip

活 細 胞

哺乳動物細胞 

105-107 細胞 佐劑，ip

106 細胞, -佐劑，iv

活癌源細胞

哺乳動物癌源細胞

104-106 細胞 佐劑，ip

106 細胞, -佐劑，iv

糖  類

多糖、糖蛋白

5-50 g,+/-佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

核  酸

核酸與載體蛋白復(fù)合物

5-50 g,+佐劑，ip

5-50 g, -佐劑，iv

ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 靜脈注射 

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