實(shí)驗(yàn)材料：

Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot

TrueBlot Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜相關(guān)設(shè)備和緩沖液；

微量移液器；

搖床；

PVDF或nitrocellulose膜；

WB結(jié)果檢測(cè)設(shè)備及底物

實(shí)驗(yàn)步驟

1）. 免疫共沉淀（IP）和SDS-PAGE電泳

(1) 細(xì)胞裂解：往107/ml細(xì)胞中加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻4度孵育30-60分鐘后10000g離心15min，保留上清液。布氏法檢測(cè)蛋白濃度后，將樣品稀釋為1 g/ l左右。可-80度凍存或繼續(xù)下一步。

(2) 細(xì)胞裂解物的預(yù)清洗：加50ul之前用裂解液稀釋的相應(yīng)種屬Ig IP Beads（or Protein A/G beads）到裝有500ul細(xì)胞裂解物的離心管中，冰上孵育30-60分鐘；2500 g離心2-3分鐘后把上清液（不能帶沉淀微球）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

(3) 免疫共沉淀：在裝有預(yù)清洗后的細(xì)胞裂解物的離心管中加入1-10ug的一抗，4 C孵育 1-2小時(shí)或者搖晃過夜。再加入50ul用裂解液預(yù)處理過的Ig IP Beads（or Protein A/G beads），4 C混勻孵育1-2小時(shí)或搖床過夜后2500 g離心0.5分鐘（可以和一抗一起孵育）。盡量完全地移去上清液并用500ul預(yù)冷的裂解液洗滌3次（每次都要離心棄完上清，有利于降低背景）。

(4) zui后一次洗滌并小心的吸掉上清液后，加入50ul 1X Laemmli sample buffer（或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer）（注意Sample Loading Buffer成分必須含有還原劑）。Vortex混勻后加熱至90-100℃，10分鐘。10000 g離心5分鐘，小心收集上清。10-30ul上樣電泳，避免上樣Beads。

注：收集的上清液可以置于-20 C保存。用時(shí)解凍后，加入新鮮的DTT并加熱至90-100℃十分鐘。10000 g離心5分鐘，收集上清進(jìn)行上樣電泳。

2）. 免疫印跡（Western Blotting）

(1) 如前所述SDS-PAGE電泳結(jié)束。

(2) 把蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。麗春紅-S染色鑒定是否轉(zhuǎn)膜成功，考馬斯亮藍(lán)對(duì)SDS-PAGE進(jìn)行染色分析轉(zhuǎn)膜效率，蒸餾水或TBST清洗麗春紅。

(3) 在通風(fēng)柜里，將NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min，TBST清洗一次。

(4) 將NC膜浸入5%的脫脂奶粉的封閉液中，置于搖床上室溫封閉2小時(shí)。

(5) 棄去封閉液后，加入靶蛋白一抗（用5%脫脂奶粉封閉液稀釋，終濃度需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，建議1-2ug/ml）。置于搖床上室溫孵育2小時(shí)或者4℃孵育過夜。

(6) 用TBST洗滌膜4-5次，每次5-10分鐘。

(7) 棄去洗液后加入適量的用5%脫脂奶粉封閉液稀釋好的TrueBlot （稀釋比為1：1000），室溫孵育1小時(shí)。

(8) 用PBST或TBST洗滌膜4-5次，每次5-10分鐘。

(9) 用合適的過氧化物酶HRP化學(xué)發(fā)光底物并按照說明（等量的底物A+底物B）進(jìn)行顯色反應(yīng)。

(10) 在暗室中用X光片曝光，根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間（10sec、1min、5min和20min）和曝光區(qū)域,以得到zui佳效果。

3）. 注意事項(xiàng)

(1) 免疫共沉淀抗體的稀釋：用于免疫共沉淀的抗體在使用之前需要進(jìn)行稀釋，例如使用濃度為1-5ug/107細(xì)胞/ml。一般對(duì)于從107細(xì)胞裂解出的大部分蛋白抗原來說，加入2ug抗體就足夠了。因?yàn)楸M量減少抗體用量可以降低還原性沉淀抗體對(duì)SDS-PAGE電泳樣品檢測(cè)的干擾。（TrueBlot 并不能增強(qiáng)免疫印跡中抗體和抗原之間的特異性結(jié)合，所以如果用于WB的抗體能與非目的蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，結(jié)果也會(huì)被TrueBlot 檢測(cè)出來）

(2) WB的封閉：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 檢測(cè)過程中的膜封閉，一抗稀釋孵育和TrueBlot 稀釋孵育過程都建議使用5%（w/v）的脫脂奶粉液。BSA不建議使用于此過程。

(3) 陽性對(duì)照：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 檢測(cè)SDS-denatured, non-reduced mouse IgG，所以可用20ng non-reduced沉淀抗體直接上樣電泳，然后WB作為IgG TrueBlot 的陽性對(duì)照。

(4) 陰性對(duì)照：WB過程中不加一抗，直接加二抗TrueBlot beads。

(5) SDS-PAGE電泳及WB：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 檢測(cè)過程為用含適量抗氧化劑上樣液電泳，然后Poncean S預(yù)染和20%的乙酸/30%甲醇脫色；再室溫自然晾干1小時(shí)，用含甲醇的Buffer A潤膜后封閉。這個(gè)操作過程可以得到很好的WB結(jié)果，PVDF膜或硝酸纖維膜都適用于此檢測(cè)過程。

4）.相關(guān)緩沖液配方：

2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

950 mL 2X SDS sample buffer

50 mL 1M DTT

注: 1小時(shí)內(nèi)使用，過期丟棄。.

2X SDS Sample Buffer

6% SDS

25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

10% glycerol

Bromphenol blue

注: -20 C長時(shí)間儲(chǔ)存 ，室溫zui多只能儲(chǔ)存一月。

TBS-Tween (TBS-T):

25 mM Tris-HCl, pH 8.0

125 mM NaCl

0.1% Tween 20

Blocking Buffer:

5g 脫脂奶粉

100ml TBS-T

調(diào)整PH值為7.4

Antibody Binding Buffer:

含1% 脫脂奶粉 TBS-T

Protease Inhibitor Cocktail (100X):

PMSF, 5mg (50 g/ml)

Aprotinin, 100 g (1 g/ml)

Leupeptin, 100 g (1 g/ml)

Pepstatin, 100 g (1 g/ml)

Phosphatase Inhibitor (100X):

1mM Na3VO4

1mM NaF

注： IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白質(zhì)印記

參考文獻(xiàn)：

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.

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