雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果不理想？看這里！

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱，其中最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別，且在動物體內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)，使其在雙報告實驗中得到廣泛應(yīng)用。

1.檢測原理

螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產(chǎn)生黃綠色光，波長540-600nm，一般檢測時選用560nm。

海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產(chǎn)生藍(lán)光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm。

不同于綠色熒光蛋白（GFP）需要一定的光激發(fā)才能發(fā)光，且易淬滅；熒光素酶經(jīng)過反應(yīng)本身就可以自發(fā)熒光，并且只有在底物存在時才能發(fā)光。因此GFP只能用于標(biāo)記或檢測反應(yīng)是否發(fā)生，而熒光素酶報告實驗卻能通過熒光值定量分析熒光素酶的表達(dá)水平。

2.應(yīng)用方向

熒光素酶作為一種理想的報告基因，可用于啟動子研究、miRNA研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究等等。

在報告基因的5 端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子的作用，啟動轉(zhuǎn)錄越多，那報告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。如果在報告基因的3 端加上目的基因的3 UTR，就能用來檢測miRNA對于目的基因的調(diào)控（抑制作用），報告基因表達(dá)越少，說明miRNA的作用就越強(qiáng)。

一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或是將兩個報告基因構(gòu)建到同一個質(zhì)粒上，分別用不同的啟動子啟動其表達(dá)。計算結(jié)果時，將螢火蟲熒光素酶的檢測值比上海腎熒光素酶檢測值，這樣就可以減少內(nèi)在變化因素對實驗準(zhǔn)確性的影響，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。

3.常見問題分析

正是由于報告基因檢測結(jié)果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等，一旦某個細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實驗失敗或結(jié)果的不準(zhǔn)確。小翊為此精心整理了大家實驗過程中遇到的幾類最常見的問題和解決辦法。

1）熒光值過高

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

A.減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

B.細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。

注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達(dá)水平，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

2）熒光值過低或無熒光值

熒光素酶的表達(dá)水平與啟動子活性相關(guān)，正常表達(dá)水平下檢測到的熒光值應(yīng)在105數(shù)量級左右，若檢測到的熒光值比較低或無熒光值，可從啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率、檢測過程這幾方面進(jìn)行考慮：

A.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實驗條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性對照（如轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒）；

B.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

C.選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

A.轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)使用特異性誘導(dǎo)啟動子的條件；

B.優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件，提高熒光素酶的表達(dá)量；

C.更換強(qiáng)啟動子（如SV40、CMV）。

注：海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照，其表達(dá)應(yīng)不受時期、部位、環(huán)境影響，因此常用組成型表達(dá)的TK啟動子。

A.細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)醉好，長時間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會難裂解；

B.加入的裂解液需足量，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

A.選擇合適的檢測儀器，能夠檢測化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光的儀器都適用于該實驗；

B.需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

C.室溫反應(yīng)。反應(yīng)時各個組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫；

D.熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成。

A.底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

B.反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）復(fù)孔重復(fù)性差

報告基因檢測實驗受多種因素影響，因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。除了引入另一個報告基因作為內(nèi)參照避免實驗條件變化的干擾之外，一般還需設(shè)置3個或3個以上復(fù)孔。想要得到一個準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性：

A.細(xì)胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；

B.保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液精準(zhǔn)；

注：熒光素酶報告基因?qū)嶒灥臋z測結(jié)果非常靈敏，復(fù)孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認(rèn)為在同一個數(shù)量級的差異是可以接受的。

以上就是大家平常給小翊反饋?zhàn)疃嗟膸讉€問題，讀完此文大家是否對這個實驗有了更深一步的認(rèn)識？如果您在實驗中還遇到其他問題，歡迎留言或電話咨詢。下面是福利時間！

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