實(shí)驗(yàn)原理

1. 細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的 DNA 和 RNA 出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA 呈藍(lán)綠色，呱咯寧染低聚分子的 RNA 呈紅色。由此對(duì)細(xì)胞中的 DNA 和 RNA 進(jìn)行定位、定性、和定量分析。
2. 由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同 pH 值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。
3. 過(guò)氧化物酶能把許多胺類(lèi)氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)判定過(guò)氧化物酶的有無(wú)或多少。
4. 組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法來(lái)顯示，其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過(guò)碘酸的氧化作用，打開(kāi)碳鏈形成醛，生成的醛基與 Schiff 試劑中的無(wú)色品紅反應(yīng)形成紫紅色化合物。

實(shí)驗(yàn)試劑

PBS 緩沖液(pH7.2)
甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液
純丙酮
l/2 丙酮 1/2 二甲苯
純二甲苯
70％乙醇
5％三氯醋酸
0.1％堿性固綠
0.1％酸性固綠
0.5％硫酸銅
聯(lián)苯胺混合液
1％番紅
無(wú)水乙醇
過(guò)碘酸酒精液
Schiff 氏酒精液
亞硫酸水
Ehrlieh
蘇木精
95％乙醇
Carnoy 固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，體積比)
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

光學(xué)顯微鏡
解剖器材
蠟盤(pán)
載玻片
吸水紙
染色缸
蓋玻片
水浴箱
實(shí)驗(yàn)材料

蟾蜍、小白鼠各一只
肝臟石臘切片
培養(yǎng)的 Hela 細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)步驟

1. Brachet 反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的 DNA 和 RNA
   (1) 接種 Hela 細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng) 24～48 小時(shí)，使長(zhǎng)成單層；
   (2) 取出蓋片，用 PBS(pH7.2)輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)?br>   (3) 放入 Carnoy 固定液中固定 l 小時(shí)；
   (4) 浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色；
   (5) 取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 2～3 次(2～3 秒鐘左右)，吸去水分。放入純丙酮中分色 2～3 秒鐘；
   (6) 放入 l／2 丙酮 1／2 二甲苯中 5 秒鐘；
   (7) 放入純二甲苯中透明 5 分鐘；
   (8) 滴一滴中性樹(shù)膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片；
   (9) 鏡下觀察。
2. 細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示
   (1) 以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤(pán)中，剪開(kāi)胸腔，打開(kāi)心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干；
   (2) 將涂片作好標(biāo)記放在 70％乙醇中固定 5 分鐘，室溫晾干；
   (3) 放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分鐘，抽提出核酸；
   (4) 清水沖洗多次（3 分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸；
   (5) 濾紙吸干玻片上水分；
   (6) 一張片放入 0.1％堿性固綠(pH8.0～8.5)中染色 10～15 分鐘,另一張片放入 0.1％酸性固綠(pH2.0～2.5)染色 5～10 分鐘；
   (7) 清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。
3. 細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的顯示
   (1) 取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開(kāi)其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜向剪斷，用 PBS 緩沖液濕潤(rùn)過(guò)的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上；
   (2) 推片，室溫晾干；
   (3) 將涂片放入 0.5％硫酸銅中浸 30 秒~1 分鐘；
   (4) 取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng) 6 分鐘；
   (5) 清水沖洗，放入 1％番紅溶液中復(fù)染 2 分鐘；
   (6) 清水沖洗，室溫晾干；
   (7) 鏡檢或封片后鏡檢。
4. 過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS) 顯示細(xì)胞內(nèi)糖原
   (1) 取 l~2mm 厚的肝組織塊，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小時(shí)；
   (2) 乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片；
   (3) 用 70％乙醇展片；
   (4) 脫蠟：二甲苯(1)5 分鐘 二甲苯(2)5 分鐘 100％乙醇 5 分鐘 含 1％火棉膠的乙醇液 1 分鐘 70％乙醇 1 分鐘；
   (5) 直接浸入過(guò)碘酸酒精液反應(yīng) 5～15 分鐘，經(jīng) 70％乙醇洗片刻；
   (6) 浸入 Schiff 氏酒精液反應(yīng) 15 分鐘；
   (7) 亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴(kuò)散的染料；
   (8) 流水沖洗 3～5 分鐘；
   (9) 蒸餾水洗；
   (10) 浸入 Ehrlich 蘇木精復(fù)染 20~30 秒，使細(xì)胞核著色；
   (11) 脫水：95％乙醇 3 分鐘二次 100％乙醇 3 分鐘二次 二甲苯透明 10 分鐘二次；
   (12) 加蓋片鏡檢或樹(shù)膠封固后鏡檢。

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