EF39A\K4 2018-01版
黃曲霉毒素B1
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物黃曲霉毒素B1將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素B1抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B1的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度: 0.02ppb孵育溫度: 25℃孵育時間: 30min~15min樣本檢測下限飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油 2 ppb
交叉反應(yīng)率黃曲霉毒素B1 100%
黃曲霉毒素M1 6.6%
黃曲霉毒素B2 54.5%
黃曲霉毒素G1 8.4%
黃曲霉毒素G2 1.7%
樣本回收飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油 95 35%
試劑盒組成1
微量測試孔
每條8孔,一板12條
2
標(biāo)準(zhǔn)液 6瓶
(1ml/瓶)
0ppb
0.02ppb
0.06ppb
0.18ppb
0.54ppb
1.62ppb
3
酶標(biāo)記物
7ml
紅色帽
4
抗體工作液
7ml
藍(lán)色帽
5
底物A液
7ml
白色帽
6
底物B液
7ml
黑色帽
7
終止液
7ml
黃色帽
8
20X濃縮洗滌液
40ml
白色帽
9
20X濃縮復(fù)溶液
50ml
透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱、打印機
微量移液器:單道 20~200 l、單道100~1000 l、多道 30~300 l
試 劑:甲醇、正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知(a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實驗結(jié)果。
樣本前處理需配制:配液1 樣本復(fù)溶液:
用去離子水將20 濃縮復(fù)溶液按1:19稀
釋(1份20 濃縮復(fù)溶液+19份去離子水)。
配液2 樣本提取液:
將甲醇與去離子水按7:3比例混合均勻(7份甲醇+3份去離子水)。
樣本處理:(a)組織、飼料、大米、玉米樣本處理方法:
取1.0 0.05g研碎的樣本于50ml離心管中;加入5ml樣本提取液,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離心10min;取上清100 l,加入700 l樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;取50 l用于分析。樣本稀釋倍數(shù):40倍
(b)食用油樣本處理方法:
取1.0 0.05g食用油樣本于50ml離心管中;加入5ml樣本提取液,再加入4ml正己烷,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離心10min;去掉上清,取中間層液體100 l,加入700 l樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;取50 l用于分析。樣本稀釋倍數(shù):40倍
(c)花生樣本處理方法:
取1.0 0.05g研碎的花生樣本于50ml離心管中;加入5ml樣本提取液,再加入4ml正己
烷,充分振蕩3min,20℃ 4000r/min以上離
心10min;
去掉上清,取中間層液體100 l,加入400 l樣本復(fù)溶液,充分振蕩混勻;
3. 取50 l用于分析
樣本稀釋倍數(shù):25倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
測定前應(yīng)須知:使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。操作步驟:從2~8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 l/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50 l/孔,再加入50 l/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干,用稀釋后的洗滌液250 l/孔洗板4~5次,每次間隔15~30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。顯色:加入底物A液50 l/孔,再加入底物B液50 l/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯色15min。測定:加入終止液50 l/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素B1量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.243; 0.02pb為1.816;0.06ppb為1.415;0.18ppb為0.74;0.54ppb為0.313;1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb~1.62ppb;樣本2的濃度范圍是0.06ppb~0.18ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際濃度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)=
B
100%
B0
B 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0 0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、 注意事項
室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作?;旌弦鶆?,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。九、儲藏條件和保質(zhì)期
儲藏條件:試劑盒于2~8℃保存,不要冷凍。保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。
農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點實室
聯(lián)合研制
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