植物病毒是一類重要病害，幾乎在各類作物上都有發(fā)生，嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，用一般的方法難以防治，是生產(chǎn)上的一大難題。因而如何對種子、苗木等無性繁殖材料進行快速檢測診斷顯得尤為重要。本文主要介紹病毒實驗室檢測植物病毒的方法。

目前植物病毒檢測主要是血清學檢測(以病毒外殼蛋白為基礎)和核酸檢測，前者主要包括ELISA、快速免疫濾紙測定、免疫膠體金技術(shù)、免疫毛細管區(qū)帶電泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信標、實時RT-PCR和核酸雜交等。

血清學檢測方法

酶聯(lián)免疫吸附測定

酶聯(lián)免疫吸附測定是一種采用固相(主要為聚苯乙烯酶聯(lián)板)吸附，將免疫反應和酶的高效催化反應有機結(jié)合的方法，其基本原理是以酶催化的顏色反應指示抗原抗體的結(jié)合。目前該方法已被廣泛用于植物病毒檢測。在此基礎上加以改進又發(fā)展了一些新的檢測方法，如A蛋白酶聯(lián)吸附(SPA-ELISA)、斑點免疫吸附(DIBA)、直接組織斑免疫測定( IDDTB) 、伏安酶聯(lián)免疫分析、快速ELISA 等。

快速免疫濾紙測定法

快速免疫濾紙測定類似乳膠凝集反應，其原理是把待測病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過大顆粒乳膠間接反應小顆粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一種紅色乳膠，從而使檢測更加簡單和直觀。RIPA目測檢測提純TMV 的靈敏度分別可達5ng/ml～50ng/ml。

免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)最早起源于電鏡方面的研究，由于金在生物學上是惰性的，且有良好的電荷分布，可以和蛋白質(zhì)(如抗體、A蛋白等)緊密結(jié)合，因此廣泛應用于生物學和微生物學的各個領域。

免疫毛細管區(qū)帶電泳

毛細管區(qū)帶電泳是在裝有一種電解液的空毛細管兩端加一個外加電壓。在外加電壓作用下，通過電泳遷移和電滲流的作用，樣品中的不同組分由于遷移率的不同而分開。免疫毛細管區(qū)帶電泳將血清學反應?；院兔毠軈^(qū)帶電泳靈敏、快速、可自動檢測的特點結(jié)合起來，實時檢測抗原- 抗體復合體Eun等應用I-CZE檢測到10fg建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)班病毒的提純病毒。

免疫PCR 

近年來出現(xiàn)的免疫PCR是一種將抗原抗體反應的高特異性與PCR 的高靈敏度有機結(jié)合的檢測技術(shù)，與酶聯(lián)檢測技術(shù)相比，免疫PCR是先用抗體來捕獲抗原，提取核酸后，再用PCR 擴增DNA 片段，從而放大抗原抗體反應，大大提高了檢測靈敏度。Sharman建立的復合免疫PCR ，可同時檢測香蕉和車前草粗提液中的香蕉苞葉花葉病毒、黃瓜花葉病毒和香蕉束頂病毒。

以病毒核酸為基礎的檢測方法

多聚酶鏈式反應(PCR)

用PCR 檢測植物病毒所需時間短，靈敏度特別高。用RT2PCR 檢測蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖溝病毒的靈敏度可達5pg。近年來，在此基礎上又發(fā)展了多種方法用于植物病毒檢測。 

分子信標(Molecular beacon) 

分子信標是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一段單鏈核酸分子，5′- 端和3′- 端序列互補形成“莖”，與目標序列互補的探針序列為“環(huán)”，在5′- 端連接熒光組分，3′- 端連接猝滅組分。

TaqMan實時定量PCR

TaqMan實時定量PCR是將RT-PCR和熒光檢測相結(jié)合，利用TaqDNA聚合酶的5′-端核酸酶活性來切割在擴增過程中與目標序列退火的熒光探針。探針5′- 端連接熒光組分，3′- 端連接猝滅組分，當探針完整時，無熒光出現(xiàn)。

核酸雜交技術(shù)

核酸雜交是先將待測核酸固定在膜上，然后用核酸探針與其進行雜交，使雜交體帶上標記而被顯示出來。一般采用核酸點雜交法來檢測植物病毒，直接把病毒核酸點到NC 膜上再使之與探針雜交;也有的直接把病毒樣品點到NC膜上。檢測的專化性程度取決于探針與病毒核酸序列的互補程度。核酸雜交技術(shù)適用于DNA病毒、RNA 病毒及類病毒的檢測，靈敏度高、特異性強，可檢測到1pg的DNA。