凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。凝膠層析是利用凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離。凝膠層析具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。

凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過(guò)單一凝膠床就可以完全將它們分開(kāi)。利用凝膠的分子篩特性，可對(duì)這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。

凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子。當(dāng)樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動(dòng)，因此流程較短，向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱。

反之，相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠粒孔隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入與逸出，使流量增長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱。

而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，經(jīng)過(guò)層析柱，使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。

Vt=Vo+Vi+Vg

Vt=πR2h

Vo簡(jiǎn)稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積?？梢杂靡粋€(gè)已知相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)超過(guò)凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍(lán)色葡聚糖-2000溶液通過(guò)柱床，即可測(cè)出柱床的外水體積Vo。

Vi簡(jiǎn)稱內(nèi)水體積，可由g·Wr求得(g為干凝膠質(zhì)量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mL/g表示)。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)(如重鉻酸鉀)的洗脫體積Ve計(jì)算，即

Ve=Vo+Vi

對(duì)某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關(guān)系可用下式表示：

Ve=Vo+Kd×Vi

式中Ve為脫體積，它包括自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。Kd為每個(gè)溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相之間的一個(gè)特定的分配系數(shù)，它只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。Kd可通過(guò)實(shí)驗(yàn)由Ve、Vo和Vi求得。

Ve=Vo+Kd×Vi

可改寫(xiě)為：

Kd=(Ve-Vo)/Vi

當(dāng)Kd=0時(shí)，Ve=Vo，說(shuō)明這種溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大，完全不能進(jìn)入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來(lái);當(dāng)Kd=1時(shí)，即Ve小分子=Vo+KdVi，說(shuō)明這種溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散，在洗脫過(guò)程中將最后流出柱外。

但實(shí)際上，約有1/5的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴(kuò)散。故實(shí)際上Ve小分子=Vo+0.8Vi;當(dāng)0 Kd 1時(shí)，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散，Kd愈大，進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大;Kd=0.5時(shí)，其洗脫體積Ve=Vo+0.5Vi。

1、凝膠層析操作簡(jiǎn)便，所需設(shè)備簡(jiǎn)單。有時(shí)只要有一根層析柱便可進(jìn)行工作。分離介質(zhì)—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生過(guò)程便可重復(fù)使用。

2、分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。

3、分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過(guò)程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對(duì)分離物的活性沒(méi)有不良影響。

4、應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測(cè)定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102～105d;Sepharose類為105～108d。

5、分辨率不高，分離操作較慢。由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時(shí)流速必須嚴(yán)格把握。因而分離操作一般較慢。而且對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時(shí)還有非特異吸附現(xiàn)象。

1、凝膠層析技術(shù)用于脫鹽

高分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過(guò)程中不易變性。

適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長(zhǎng)與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。

2、凝膠層析技術(shù)用于分離提純

凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。

3、凝膠層析技術(shù)測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量

用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一種成分(已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品)的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。

4、凝膠層析技術(shù)高分子溶液的濃縮

通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過(guò)濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。