帶有相反電荷的兩個離子依靠庫侖引力結(jié)合成的一對離子。在溶液中，一個離子對(ion pair)在電導(dǎo)率、動力學(xué)、滲透性等方面的行為猶如一個整體。

離子直接接觸形成的離子對稱為緊密離子對，用符號x+y-。表示離子間間隔一個或幾個溶劑分子或其他中性分子而形成的離子對稱為松散離子對，用符號x+‖y-表示。

在溶液中，松散離子對之間或其與自由離子之間易發(fā)生離子交換(可用同位素標(biāo)記法來測定)。溶液濃度愈大，離子的電荷數(shù)愈多，溶劑的相對介電常數(shù)愈小，則離子對的形成愈是普遍。

常見不能共存的離子對

H++OH-=H2O

H++CO32-=H2O+CO2↑

H++HCO3-=H2O+CO2↑

NH4++OH-=H2O+NH3↑

Cu2++OH-=Cu(OH)2↓(藍(lán)色)

Fe3++OH-=Fe(OH)3↓(紅褐色)

Mg2++OH-=Mg(OH)2↓(白色)

Al3++OH-=Al(OH)3↓(白色)

Zn2++OH-=Zn(OH)2↓(白色)

Ba2++CO32-=BaCO3↓(白色)

Ca2++CO32-=CaCO3↓(白色)

Mg2++CO32-=MgCO3↓(白色)

Ba2++SO42-=BaSO4↓(白色，且不溶于稀硝酸)

Ag++Cl-=AgCl↓(白色，且不溶于稀硝酸)

離子對試劑

離子對試劑的定義：離子對試劑是由強(qiáng)親水離子形成，反作用于樣品分子的中性離子對。因此，可用于同時(shí)分離帶電分子和非帶電分子。

適用范圍：一般可適用所有色譜固定相。當(dāng)使用長鏈的離子對試劑時(shí)，如：十六烷基硫酸銨或十二烷基硫酸鈉，色譜柱將選用反相色譜柱。

使用濃度：離子對試劑的適用濃度短鏈離子對試劑：5×10-3mol/L長鏈離子對試劑：5×10-4mol/L。

離子對試劑作用：

使用液相色譜法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。就像是一個物質(zhì)要穿色譜柱而過時(shí)，我們使用離子對試劑將它留住。

離子對試劑是在高效液相色譜法中引入了離子色譜方法的一種表現(xiàn)。它主要是作用于樣品和固定相之間的一種物質(zhì)，所以在選擇離子對試劑時(shí)，要考慮色譜柱的填料和樣品的酸堿性。

離子對試劑的選擇：

離子對試劑的種類和濃度對分離效果都有較大的影響。離子對試劑種類的選擇依賴于被分離樣品的性質(zhì)。被分離溶質(zhì)是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，離子對試劑可以是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，弱堿或強(qiáng)酸，弱酸。

如被分離的溶質(zhì)是弱酸或弱堿，則選用的離子對試劑必須是強(qiáng)堿或強(qiáng)酸。對于溶質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)相差較大的混合樣品，離子對試劑種類的選擇并沒有特殊要求。離子對試劑疏水性的差別可以通過調(diào)節(jié)離子對試劑濃度和有機(jī)溶劑濃度獲得滿意的分離效果。

離子對試劑用于高壓液相離子對萃取的液相色譜法分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的好方法。廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)，藥物學(xué)，和石油化工等領(lǐng)域。

用于酸性化合物：

①四丁基氫氧化銨(10%水溶液);

②四丁基溴化銨;

③十二烷基三甲基氯化銨。

用于堿性化合物：

①戊烷磺酸鈉;

②己烷磺酸鈉;

③庚烷磺酸鈉;

④辛烷磺酸鈉;

⑤癸烷磺酸鈉。

離子對試劑是高效液相色譜專用試劑，主要分析測試有機(jī)堿類離子化合物，代替離子交換法，具有可靠的分離效果。也可用于分析多肽和蛋白質(zhì)，是制備抗靜電聚脂纖維的中間體。

反向離子對色譜

反相離子對色譜采用目前使用最為廣泛的反相高效液相色譜柱，在一般的通用型高效液相色譜儀上，一次運(yùn)行可同時(shí)分離分析離子型和中性化合物，分析速度快，效率高且操作簡便，因此近年來越來越受到人們的重視。

反相離子對色譜多以C8或C18鍵合相作為固定相，用含有離子對試劑的有機(jī)溶劑-水溶液作為流動相。反相離子對色譜法兼有反相色譜和離子色譜共同的優(yōu)點(diǎn)，因此在藥物分析、生化樣品分析、染料及其中間體等領(lǐng)域獲得了日益廣泛的應(yīng)用。

由于反相離子色譜法中使用了離子對試劑和無機(jī)鹽，因此在操作上要注意以下幾個方面：

1、改變沖洗劑濃度或梯度沖洗操作后，柱系統(tǒng)的沖洗時(shí)間要長些，以保證柱內(nèi)平衡;

2、實(shí)驗(yàn)停止后須用純水或甲醇/水沖洗進(jìn)樣閥、高壓泵及色譜柱，以防流動相腐蝕設(shè)備和擔(dān)體;

3、一經(jīng)發(fā)現(xiàn)離子對試劑在柱內(nèi)產(chǎn)生了不可逆吸附，則須用甲醇沖洗柱子。

一、反相離子對色譜的性質(zhì)

由于反相離子對色譜是在反相系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)的，除了在流動相中加入適量的離子對試劑外，其它條件與反相色譜法完全相同。在實(shí)際操作中影響離子性質(zhì)樣品保留值大小的因素主要有：

1、固定相的鍵合量和碳鏈長度;

2、離子對試劑的疏水作用力強(qiáng)弱、電荷數(shù)和在流動相中的濃度;

3、流動相的酸度;

4、流動相中強(qiáng)組分的性質(zhì)和濃度;

5、流動相中的離子強(qiáng)度。

在一個選定的反相色譜柱系統(tǒng)中，選擇合適的離子對試劑是進(jìn)行分離的首要條件。下表列出的是常用離子對試劑類型和主要應(yīng)用對象。

一般來說，所選用的離子對試劑的電荷應(yīng)與被分離的樣品的電荷相反，如對于酸性或帶負(fù)電荷的溶質(zhì)，多用帶正電荷的季胺鹽作為離子對試劑，而對堿性或帶正電荷溶質(zhì)，多用烷基磺酸鹽(或硫酸鹽)作為離子對試劑，這是兩類最常用的離子對試劑。下表列出的是對一些樣品選擇流動相pH值的基本原則。

由于反相離子對色譜大多都用烷基鍵合固定相，所以流動相的pH值應(yīng)控制在2～8.0范圍內(nèi)，以防止硅膠基質(zhì)的溶解。反相離子對色譜法對鍵合固定相的要求是盡可能選用烷基復(fù)蓋度高的填料(如C18、C8)，而短鏈烷基鍵合固定相的穩(wěn)定性較差。為了防止鹽析現(xiàn)象，流動相緩沖液中的鹽濃度不宜太高，一般在10～20mmol/L范圍內(nèi)。

二、反相離子對色譜的分離機(jī)理

關(guān)于離子對色譜法的保留機(jī)理，目前有三種模型或理論來解釋所觀察到的現(xiàn)象和結(jié)果：其一是離子對模型，其二是動態(tài)離子交換模型，最后是離子作用機(jī)理。

根據(jù)離子對模型，認(rèn)為樣品離子在吸附劑表面吸附之前先在流動相中與離子對試劑形成中性的離子對。樣品的保留值由對固定相親合力大小起決定作用的離子對試劑濃度所控制。烷基碳鏈較大的離子對試劑使得形成的離子對與固定相親合力較大，因此被分離的溶質(zhì)離子保留值也較大。

根據(jù)動態(tài)離子交換模型，認(rèn)為離子對試劑在流動相與溶質(zhì)離子形成離子對之前先吸附在固定相表面，使得固定相具有離子交換的性質(zhì)，樣品的分離由靜電作用力的差別而實(shí)現(xiàn)。由于烷基碳鏈較大的離子對試劑在固定相表面吸附量較大，因此對離子性質(zhì)的樣品交換容量大，其保留值也較大。

離子作用模型假定離子對試劑在固定相和流動相間形成吸脫附平衡，吸附的離子對試劑在固定相表面形成雙電層。由于離子對試劑的電荷數(shù)相同，它們在固定相表面排列均勻，但復(fù)蓋很少一部分固定相表面，大部分固定相表面仍是非極性的鍵合碳鏈。離子性質(zhì)的樣品主要由離子對試劑形成的雙電層的靜電作用力和固定相表面的非靜電作用力決定其保留值。由于離子對試劑在流動相和固定相間存在動態(tài)平衡，當(dāng)流動相中離子對試劑濃度升高時(shí)，或烷基碳鏈增大時(shí)，吸附在固定相表面的量增大，電荷密度增加，離子性質(zhì)的樣品保留值也增大。

在反相離子對色譜中，以上這三種模型都能解釋一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果?，F(xiàn)在一般認(rèn)為只有當(dāng)離子對試劑疏水作用力很弱(如無機(jī)離子作為離子對試劑)而濃度較高時(shí)，離子對保留機(jī)理可能成為主要分離機(jī)制;而當(dāng)離子對試劑的疏水作用力較強(qiáng)時(shí)，則離子作用是主要的分離機(jī)理。

最近Stahlberg等應(yīng)用靜電作用理論對離子對色譜的各種因素對保留值的影響作了定量解釋。我們應(yīng)用統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)模型，考慮到靜電和非靜電作用力的影響，推導(dǎo)出流動相有機(jī)溶劑Cb和離子對試劑濃度Cp及離子強(qiáng)度I對保留值影響的基本關(guān)系式為：

并應(yīng)用大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些基本關(guān)系式。同時(shí)證明參數(shù)b在多數(shù)情況下可以忽略不計(jì)。

從下圖中可以看到隨著沖洗劑有機(jī)溶劑濃度的增大，k’迅速減小，這是因?yàn)閺?qiáng)組分濃度增加，使得流動相與有機(jī)離子的非靜電作用力增大，同時(shí)使在固定相表面的離子對試劑的吸附量減小。這兩個變化都促使保留值減小。

從下圖中可以看到，在離子對試劑濃度較低時(shí)，隨著Cp的增加，溶質(zhì)的k’值迅速增大;而當(dāng)離子對試劑濃度達(dá)到一定值時(shí)，繼續(xù)增加Cp值，溶質(zhì)的k’值變化不大，有的甚至有下降。

我們認(rèn)為產(chǎn)生下圖所示的結(jié)果是在離子對試劑濃度較低時(shí)，隨著Cp的增加，與溶質(zhì)產(chǎn)生靜電作用的雙電層電荷密度也迅速增加，保留值迅速增大，而Cp達(dá)到一定值時(shí)，由于吸附態(tài)離子對試劑相互排斥作用，吸附在固定相表面的離子對試劑量基本達(dá)到動態(tài)平衡，再增大Cp值時(shí)作用不大，所以溶質(zhì)的保留值也趨向于恒定值。

從上圖中可以看到離子對試劑濃度一般在10～25mmol/L范圍內(nèi)。對于pKa 2的強(qiáng)酸和pKa 8的強(qiáng)堿，pH值對保留值的影響不大，但對于PKa 2的中弱酸和pKa 8的中弱堿，沖洗劑酸度對保留值的影響很大，此時(shí)沖洗劑pH值也是一個重要的調(diào)節(jié)參數(shù)。

下圖表明隨著離子強(qiáng)度的增大，溶質(zhì)的保留值不斷下降，這與反相色譜中離子強(qiáng)度對k’的影響相反，這一現(xiàn)象的原因可能是反相離子對色譜中增大離子強(qiáng)度減少溶質(zhì)與離子對試劑的靜電作用力所致。

三、反相離子對色譜法的應(yīng)用

離子對色譜主要用于能電離的或有離子性質(zhì)的有機(jī)化合物或離子性和中性溶質(zhì)的混合物的分離。由于生理、生化中和工業(yè)產(chǎn)品中許多重要的化合物是水溶性的能電離的化合物，因此選擇反相離子對色譜法分離檢測這些樣品是很合適的。

1、在藥物分析中的應(yīng)用

在醫(yī)藥工業(yè)和相關(guān)的領(lǐng)域中，原材料和產(chǎn)品的成分監(jiān)測是很重要的工作;同時(shí)新藥物試制和藥理動力學(xué)的研究也需要有效地測定藥物和經(jīng)藥理過程中代謝產(chǎn)物的各種成分。

由于很多藥物成分和相應(yīng)的化合物極性很大，水溶性很好且可離解為帶電性溶質(zhì)，用反相色譜分離測定這樣的樣品很困難，因此用離子對色譜法對藥物成分和生理代謝產(chǎn)物的測定已成為一種很重要的技術(shù)。已有59類藥物成分的幾百個組分用反相離子對色譜獲得很好分離分析，國內(nèi)也有用反相離子對色譜測定中草藥成分和西藥成分的報(bào)道。

2、分離氨基酸、肽和蛋白質(zhì)

高效液相色譜法在生物化學(xué)中的應(yīng)用已對生物化學(xué)本身的研究和發(fā)展起到了重要的作用。生物化學(xué)最重要的研究對象之一是蛋白質(zhì)、多肽、小肽和氨基酸的含量和活性。由于這一類樣品在一定的pH值下都可電離成離子性化合物，因此從理論上講這一類化合物如在反相色譜中無保留，都可用離子對色譜法進(jìn)行分離。

近年來反相離子對色譜法已在這一領(lǐng)域中，尤其是在氨基酸和聚合度較低的小肽的分離和測定中獲得廣泛的應(yīng)用。已有四十多種類的氨基酸及其衍生物、肽和多肽以及蛋白質(zhì)混合物在反相離子對色譜分離測定的報(bào)道。下圖是反相離子對色譜法分離中等聚合度的堿性肽混合物的色譜圖。

3、在核酸及降解產(chǎn)物分析中的應(yīng)用

由于在生物體液和細(xì)胞組織中發(fā)現(xiàn)了核酸及其降解產(chǎn)物的存在，監(jiān)測這些成分的含量對各種疾病的診斷和治療都有重要的指導(dǎo)意義。

核酸的單元由一個嘌呤或吡啶堿、一個糖元和磷酸基組成，由于這些堿基是弱堿，而核甙酸糖基是強(qiáng)酸，因此由傳統(tǒng)的單一液相色譜分離模式很難對這些混合物進(jìn)行有效的分離，而反相離子對色譜恰好能滿足這樣的要求。

現(xiàn)有用反相離子對色譜法分離分析核甙酸、單核糖核甙酸、腺嘌呤核甙酸、堿基嘌呤和尿嘌呤混合物的報(bào)道。還有文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)分離測定這單核糖核甙酸等幾類組分混合物的方法。

4、在染料及其合成中間體分析中的應(yīng)用

在染料的分離分析中，傳統(tǒng)的方法是紙上色譜、薄層色譜和經(jīng)典的柱色譜法。隨著高效液相色譜法的引入，使染料及其合成中間體的分離分析獲得長足的進(jìn)步。

染料可分成水溶性和脂溶性兩大類，其中水溶性染料及其合成中間體的很大一部分化合物是酸性或堿性可電離的化合物，而且在反相色譜中保留值很小，因此用離子對色譜法分離分析這一類產(chǎn)品和合成中間體很有效。

離子對色譜已被用于分離測定食品染料、食品添加劑成分、食品染料中雜質(zhì)的檢測;還有利用反相離子對色譜法分離測定著色染料、化妝品染料染料合成中間體和研究染料中間體反應(yīng)動力學(xué)過程。