印跡法(blotting)指的是往固相載體上轉(zhuǎn)移樣品,之后通過相應(yīng)的探測反應(yīng)來進行樣品的檢測的一種方法。
1975年,往硝酸纖維素膜(NC膜)上轉(zhuǎn)移DNA,并且通過DNA-RNA雜交來對特定的DNA片段進行檢測的方法被Southern建立了,被叫做Southern印跡法。在此之后,對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分、對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析以及對RNA的印跡分析也被使用了類似的方法,這些方法分別叫做Eastern印跡法、Western印跡法以及Northern印跡法。
蛋白質(zhì)印跡法首先是從凝膠中向硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移電泳后分離的蛋白質(zhì),一般分為毛細管印跡法和電泳印跡法兩種方法。
毛細管印跡法
毛細管印跡法是在由緩沖液浸濕的濾紙上放置凝膠,將一片硝酸纖維素膜放置在凝膠上,然后再將一層吸水物質(zhì)(如濾紙等)放在上面并且使用重物將其壓好,那么在過毛細作用下緩沖液就會從凝膠流過,當緩沖液從凝膠經(jīng)過的時候,蛋白質(zhì)就會被其帶到硝酸纖維素膜上,通過疏水,硝酸纖維素膜能夠和蛋白質(zhì)相互作用使得不可逆的結(jié)合形成。這個過程持續(xù)過夜,就能夠往硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移凝膠中的蛋白質(zhì),然而這種方法具有比較低的效率,一般僅僅有10%~20%蛋白質(zhì)從凝膠中被轉(zhuǎn)移。
電泳印跡法
若想要更快速有效的進行轉(zhuǎn)移,就可以使用電泳印跡法。這種方法是凝膠和硝酸纖維素膜被有孔的塑料和有機玻璃板夾成“三明治”形狀,在此之后往兩個平行電極中間的緩沖液中浸入,進行電泳。為了使得蛋白質(zhì)從凝膠離開在硝酸纖維素膜結(jié)合,需要對電泳方向進行適當?shù)倪x擇。
印跡(blot)就是轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜的一個稱謂,被用來進一步檢測蛋白質(zhì)。首先用蛋白溶液(如10%的BSA)對印跡進行處理,從而將硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點封閉掉,之后處理使用所要研究的蛋白質(zhì)的抗血清(一抗),在印跡中,其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合,與一抗結(jié)合的只有待研究的蛋白質(zhì),如此,將未結(jié)合的一抗清洗去除之后,印跡中結(jié)合著一抗的就僅有待研究的蛋白質(zhì)的位置。進一步用適當標記的二抗來對處理過的印跡進行處理,一抗的抗體指的就是二抗,就相當于如果是從鼠中獲得的一抗,那么抗鼠IgG的抗體就是二抗,在處理之后,一抗的位置,也就是待研究的蛋白質(zhì)的位置能夠通過帶有標記的二抗與一抗結(jié)合被指示出來。