嚙齒動(dòng)物固定的目的是為了快速且均勻地將組織保持于特定的生存狀態(tài)。雖然將組織直接放置在固定液中可以很好地用于小塊組織的固定。但是像完整大腦，心臟這樣的較大樣本會(huì)引起浸入式固定的問題，因?yàn)楣潭ㄒ翰⒉粫?huì)以相同的速率到達(dá)組織的所有區(qū)域，而組織往往在固定液進(jìn)入前即發(fā)生缺氧反應(yīng)。利用循環(huán)系統(tǒng)直接灌注固定液的優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)物質(zhì)可以使用天然的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)快速到達(dá)生物體的各個(gè)角落以達(dá)到整體固定的效果。我們尋找的方式就是介紹一種低成本，快速，可控和統(tǒng)一的固定方法，使用4％多聚甲醛通過血管系統(tǒng)灌注以獲得大鼠大腦最好的固定。此方法視頻由密歇根大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系Gregory J. Gage等人制作。

以下為具體實(shí)驗(yàn)方法：

1.準(zhǔn)備固定液

2.準(zhǔn)備灌注緩沖液

3.準(zhǔn)備儀器和麻醉

3.1通過水浴加溫將灌注緩沖液加溫至37 C。將出口閥放入裝有緩沖液的燒杯中。用緩沖液填充50 ml注射器并連接到固定管。通過排出緩沖液反復(fù)沖洗管道。

3.2用緩沖液反復(fù)沖洗管道。直到管道中的所有氣泡都被排出。

3.3取下注射器并連接4％多聚甲醛固定液（室溫）容器。為了避免管端處的氣泡，在將管定位到容器中的同時(shí)擠壓管排出氣泡。

3.4關(guān)閉出口（針頭端）。將緩沖閥（藍(lán)色）轉(zhuǎn)到與固定閥（白色）相同的位置。使緩沖液得以流出。

3.5打開出口端口并重復(fù)步驟3.1至3.3以填充緩沖液。并消除所有氣泡。

3.6利用橡膠泵使測試系統(tǒng)中保持灌注所需的一定壓力。

3.7在系統(tǒng)中安裝所需設(shè)備，方便操作。

3.8在手術(shù)之前，通過腹膜內(nèi)注射（給予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物維持麻醉。

4.手術(shù)灌注

4.1一旦動(dòng)物到達(dá)手術(shù)所需的麻醉程度，將其放在裝滿碎冰的淺盤上。

4.2在肋骨下方的體表和腹壁做一個(gè)5-6厘米的側(cè)切口。小心地將肝臟與隔膜分開。

4.3使用彎曲的鈍剪刀在隔膜上做一個(gè)小切口。

4.4沿著肋骨的整個(gè)長度繼續(xù)隔膜切口以暴露胸膜腔。
4.5沿著肋骨的一側(cè)放置彎曲的鈍剪刀，小心地移動(dòng)肺部，并通過肋骨切割至鎖骨。在對(duì)側(cè)進(jìn)行類似的切割。
4.6抬起胸骨，仔細(xì)修剪連接心臟的組織。用止血鉗夾住胸骨尖端，將止血鉗放在頭上。

4.7使用虹膜剪刀在左心室后端做一個(gè)小切口。

4.8將15號(hào)鈍頭或橄欖尖灌注針穿過切開的心室進(jìn)入升主動(dòng)脈。

4.9使用止血鉗夾住心臟，這可以固定針頭并防止泄漏。

4.10使用虹膜剪刀在動(dòng)物的右心房切開，以盡可能大的出口，而不會(huì)損壞降主動(dòng)脈。此時(shí)動(dòng)物即準(zhǔn)備好灌注。

5.灌注

5.1打開灌注系統(tǒng)并將出口連接到針座，注意不要引入任何氣泡。

5.2將壓力計(jì)顯示壓力快速均勻地抽吸至80mm Hg。

5.3調(diào)整針角以實(shí)現(xiàn)最大流速。

5.4一旦緩沖液灌注幾乎完成（200毫升），切換緩沖閥（藍(lán)色）至固定液。

5.5當(dāng)固定開始幾秒鐘內(nèi)可觀察到固定震顫，即為固定開始。

5.6壓力逐漸增加至最大130 mm Hg，以保持穩(wěn)定的流速。

5.7一旦固定液接近完成，關(guān)閉出口閥。完成灌注。

5.8完成灌注后，大鼠應(yīng)為僵硬狀態(tài)。

5.9根據(jù)要求處理所用緩沖液及灌注液。

6.解剖

6.1利用剪刀取下頭部。

6.2從頸部到鼻子沿著體表做一個(gè)中線切口，露出顱骨。
6.3修剪剩下的頸部肌肉，露出顱底;使用剪刀或咬骨鉗去除任何殘留的肌肉。

6.4將一把虹膜剪刀的尖端放在一側(cè)的枕骨大孔上，小心地沿著頭骨的內(nèi)表面滑動(dòng)剪刀。
6.5切割延伸到后顱骨表面的遠(yuǎn)端邊緣。在對(duì)側(cè)進(jìn)行相同的切割。使用咬骨鉗清除小腦周圍的頭骨。
6.6當(dāng)尖端從背側(cè)遠(yuǎn)端后角移動(dòng)到顱骨的遠(yuǎn)端前緣時(shí)，小心地沿著顱骨內(nèi)表面滑動(dòng)剪刀，在切割時(shí)抬起刀片以防止損壞大腦。
6.7使用咬骨鉗將顱骨的背面剝離遠(yuǎn)離大腦。使用咬骨鉗修剪頭骨的兩側(cè)。
6.8使用刮刀，切斷嗅球和沿大腦腹面的神經(jīng)連接。

6.9輕輕地將大腦從頭部取出，修剪大腦連接到頭骨的硬骨膜。
6.10取出大腦并將其放入一瓶含有至少10倍于大腦本身體積的固定液中。并適時(shí)地轉(zhuǎn)動(dòng)小瓶。

7.后固定及儲(chǔ)存

7.1將大腦置于4 C固定液中24小時(shí)并適時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)。

7.2 24小時(shí)后用3倍存儲(chǔ)液的磷酸鹽緩沖液清洗大腦并適時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)。

7.3可將腦保存在4 C磷酸鹽緩沖液或含有疊氮化鈉的HBHS中。

8.灌注效果

灌注成功的最初指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四肢的顏色及僵硬度。大腦的大體檢查顯示血管無血液。在用于染色和組織切片中也是如此。灌注結(jié)果的最終指標(biāo)是組織中超微結(jié)構(gòu)的狀況。