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NADP

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-08-27  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):354
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義:
MDH (EC 1.1.1.37)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH 在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,MDH 分為NAD- 依賴的 MDH 和NADP-依賴的 MDH, NADP-MDH 主要存在于真核細(xì)胞中。
測定原理:
NADP-MDH 催化 NADPH 還原草酰乙酸生成蘋果酸,導(dǎo)致 340nm 處光吸收下降。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一、提取液 60 mL 1 瓶,在 4℃保存; 試劑二、液體 50 mL 1 瓶,在 4℃保存;
試劑三、粉劑 2 支,-20℃保存;臨用前加入 300 L 蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四、粉劑 2 支,-20℃保存;臨用前加入 300 L 蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
樣本測定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。
3、操作表:
將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中,混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應(yīng) 1min
后的吸光度 A2,計(jì)算 A=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需將樣本用提取液稀釋,使 A1-A2 小于 0.5,可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
 
 
 
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