除了考慮血清和細菌污染的問題，
也不要忽視細胞老化

細胞老化有哪些表現(xiàn)？
  1.細胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點，大多沿細胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊為少。
2.老化以后的細胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起，細胞不再是梭形，而會成為各種不規(guī)則形狀。
3.細胞折光性變差，鏡下可見細胞 變薄 ，做轉染實驗時，細胞死亡率會較高。但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（但如果是細菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話，細胞也會失去正常形態(tài)，會有細胞的死亡）。
4.細胞的貼壁性減弱，開始有細胞漂浮于培養(yǎng)液中。
5.老化的細胞，表面分泌物會增多，細胞表面的純凈度越來越低。
6.分裂的細胞數(shù)量明顯的減少同時細胞的增殖速度也會大大下降。 
7.細胞開始長角分化。

圖1 HEK293細胞                 圖2  MSC細胞

圖1  實心箭頭指示的是發(fā)生細胞老化的HEK293細胞，SA- -gal染色陽性，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細胞。圖2  被染上藍色的是發(fā)生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細胞。
由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。

  細胞老化，可能有這些原因？

1.在體外傳代次數(shù)太多或太久

2.培養(yǎng)液營養(yǎng)不夠

3.接種密度不當

4.培養(yǎng)液pH偏離

  如何預防細胞老化？

防止細胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細胞太密了之后傳，一般細胞建議長到70％融合度傳代最好。

換培養(yǎng)液應該根據(jù)自己細胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結論。

選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細胞對血清特別敏感，直接影響細胞的生長。一定要選擇適合的血清不然就會因營養(yǎng)物質不協(xié)調而導致細胞老化。

在間充質干細胞培養(yǎng)時必然要進行消化，但是消化對細胞的表面蛋白質有很強的破壞作用，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化。 

在開始養(yǎng)細胞傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子存在，可以有效避免細胞損傷。

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