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蛋白樣品：
準(zhǔn)備好裂解液后，使用BCA或Bradford等檢測(cè)方法仔細(xì)測(cè)量蛋白濃度。進(jìn)行上樣時(shí)，確保加入等量的蛋白樣品，以確保公平比較，從而最大限度地減少上樣誤差。不要使凝膠過(guò)載！如果您的表達(dá)目標(biāo)非常低，可選擇加樣孔體積大的凝膠，這樣可提高上樣量。
陽(yáng)性和陰性對(duì)照：
這些質(zhì)控對(duì)于證明您的結(jié)果有效至關(guān)重要。陽(yáng)性對(duì)照通常是裂解物或組織提取物，其具有過(guò)度表達(dá)的蛋白。當(dāng)您的陽(yáng)性對(duì)照未能發(fā)出信號(hào)時(shí)，您知道該方法可能存在問(wèn)題。如果您正在使用重組蛋白，那么包含內(nèi)源形式靶標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照也是一個(gè)好主意。這將有助于理清與一抗相關(guān)的任何特異性問(wèn)題。陰性對(duì)照同樣也有價(jià)值，通常是不會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)的裂解物或組織提取物。最好的陰性對(duì)照由敲除或未處理的細(xì)胞系制備。
內(nèi)參對(duì)照：
有幾種廣泛可用的上樣對(duì)照抗體，如GAPDH，actin 或 tubulin。由于這些蛋白表達(dá)豐度高，因此在適應(yīng)低豐度目標(biāo)的樣品表達(dá)看到內(nèi)參對(duì)照蛋白的過(guò)飽非常常見(jiàn)。這里最大的挑戰(zhàn)是內(nèi)參對(duì)照和靶蛋白在相同的樣品稀釋系列中通常具有不同的線性，影響定量的準(zhǔn)確性，對(duì)于目的蛋白表達(dá)比較低的蛋白，可選擇低表達(dá)的內(nèi)參例如Lamin B1和HSP60等蛋白。此外，研究人員需要證明內(nèi)參蛋白的表達(dá)不會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件的變化而改變。
在第一個(gè)檢測(cè)線性范圍重疊的地方，蛋白質(zhì)在該重疊區(qū)域內(nèi)的定量將是很好的。然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質(zhì)濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強(qiáng)度，而不影響另一種蛋白質(zhì)的條帶強(qiáng)度。在這種情況下，定量是不準(zhǔn)確的。
轉(zhuǎn)移效率/總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化：
轉(zhuǎn)印完成后，最好評(píng)估轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白量以及凝膠中剩余的蛋白量。通過(guò)評(píng)估整個(gè)蛋白范圍，產(chǎn)生更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍。這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。例如AzureRed熒光蛋白染色是一種用于凝膠和印跡膜的定量總蛋白染色試劑，與下游蛋白分析兼容。AzureRed是染色應(yīng)用的理想選擇，包括轉(zhuǎn)印后染色以確認(rèn)從凝膠到膜的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況，以及定量蛋白。執(zhí)行這些檢查不僅可以讓您對(duì)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展充滿信心，現(xiàn)在很多期刊雜志都推薦使用總蛋白定量的方法來(lái)進(jìn)行質(zhì)控，以證明數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
圖1. AzureRed與三種感興趣的蛋白同時(shí)成像。
向凝膠中加入稀釋的HeLa細(xì)胞裂解物。轉(zhuǎn)印后，將印跡用AzureRed染色，然后在不脫色情況下加入tubulin， -actin和GAPDH探針。用Azure Sapphire 雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)掃描成像。四個(gè)通道進(jìn)行疊加，總蛋白質(zhì)（AzureRed染色）以灰色顯示;tubulin-紅色， -actin-藍(lán)色和GAPDH-綠色。
不加入一抗：
這是一個(gè)簡(jiǎn)單但經(jīng)常被遺忘的WB印跡控制。通過(guò)僅僅加入二抗孵育印跡，您將能夠清楚地看到由于實(shí)驗(yàn)中使用的二抗而產(chǎn)生非特異性的條帶。
