文章導(dǎo)讀
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué) 的概念是通過轉(zhuǎn)錄后修飾影響RNA的結(jié)構(gòu)和功能,是近幾年來生物學(xué)科里熱門的研究領(lǐng)域之一,目前已知的天然RNA修飾類型超過150種,之前我們已經(jīng)介紹很多關(guān)于m6A、m5C、m1A和m7G的相關(guān)內(nèi)容。目前,ac4C RNA乙?;揎椬鳛橐活愋滦蚏NA修飾,是繼m6A修飾之后又一表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)熱點和 超級潛力股 !
ac4C RNA乙?;窃赗NA ac4C修飾酶的作用下,使N4位乙酰胞嘧啶發(fā)生乙?;囊环N保守的化學(xué)修飾(N4-acetylcytidine)。早期研究發(fā)現(xiàn)該修飾存在于真核生物中絲氨酸及亮氨酸t(yī)RNA和18S rRNA上,導(dǎo)致Watson-Crick堿基配合鳥苷的熱穩(wěn)定性增加,調(diào)控蛋白合成中的編碼準(zhǔn)確性;近期研究發(fā)現(xiàn)ac4C廣泛分布在人類轉(zhuǎn)錄組中,大多數(shù)位點出現(xiàn)在編碼序列(CDS)內(nèi),并且通過改善的mRNA穩(wěn)定性和翻譯促進靶基因表達。
今天小編為大家解析一篇Cell發(fā)表的關(guān)于ac4C RNA修飾的文章,希望能給大家?guī)硎斋@!
美國國家癌癥研究所(NCI)和弗雷德里克國家實驗室探究發(fā)表了ac4C的文章,并將該成果發(fā)表在了國際頂級期刊Cell(影響因子=36.22)中。該研究,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10(RNA去乙?;福┠軌蛞种艸ela細胞的增殖;并且下調(diào)NAT10后,mRNA ac4C的總體水平下降;為了進一步探究mRNA ac4C修飾的特點,作者對WT和下調(diào)NAT10的Hela細胞進行acRIP-seq和RNA-seq(云序生物提供此項服務(wù)),發(fā)現(xiàn)ac4C 的peak主要富集在mRNA的CDS區(qū),且與靶mRNA的下調(diào)有很大關(guān)系;這預(yù)示著ac4C可能與mRNA的翻譯相關(guān),作者從mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率著手探究,發(fā)現(xiàn)ac4C乙?;揎椡ㄟ^延長mRNA的半衰期促進mRNA的穩(wěn)定性;通過ac4C peak中的密碼子偏好性促進mRNA翻譯效率。這些發(fā)現(xiàn)不僅擴大了mRNA修飾范圍(包括乙?;瘹埢泊_立了ac4C在mRNA翻譯調(diào)控中的作用。
原文鏈接:https://www.sci-hub.shop/10.1016/j.cell.2018.10.030
發(fā)表期刊:Cell
影響因子:36.22
實驗方法:acRIP-seq、RNA-seq等
技術(shù)線路
注:云序提供acRIP-seq和RNA-seq服務(wù)
文章內(nèi)容
(1)NAT10的功能探究
1)NAT10的細胞層面和分子層面表型探究
NAT10是RNA乙?;福瑸榱颂骄縍NA乙?;╝c4C)對RNA的結(jié)構(gòu)和功能的影響。作者首先探究了NAT10的功能。在Hela細胞中,下調(diào)NAT10后,發(fā)現(xiàn)能夠抑制細胞周期,抑制細胞的增殖能力(圖D和E)。為了進一步探究NAT10的功能,作者在siNC和siNAT10轉(zhuǎn)染的Hela細胞中做了RNA-seq,通過GO功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)差異mRNA與Hela細胞凋亡相關(guān)(圖G),這與前面的細胞表型結(jié)果是一致的。
圖1:NAT10在細胞和分子層面上功能探究
2)NAT10對mRNA ac4C修飾水平的影響
那么NAT10對mRNA ac4C修飾水平的影響是怎么樣的呢?作者通過HPLC方法,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠明顯降低mRNA ac4C的修飾水平(圖D)。
圖2:NAT10能夠影響mRNA ac4C的整體水平
(2)找NAT10的下游靶基因
ac4C RNA-seq和RNA-seq聯(lián)合分析:為了進一步探究NAT10對下調(diào)靶基因的調(diào)控,作者做了RNA 乙?;瘻y序(acRIP-seq)和RNA-seq,并進行生信分析
1)acRIP-seq結(jié)果展示
acRIP-seq測序方法(圖A);統(tǒng)計顯示有4,251個ac4C peaks(圖E);ac4C peak峰主要分布在mRNA的CDS區(qū)(圖H);靶mRNA的可視化結(jié)果,從左到右依次ac4C修飾高富集、中富集、無富集(圖F)。
圖3:acRIP-seq原理及部分生信分析結(jié)果
2)acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析結(jié)果展示
火山圖展示ac4C修飾隨下調(diào)的靶基因影響比較明顯(圖B);并且ac4C修飾主要發(fā)生在下調(diào)靶mRNA的CDS區(qū)(圖D);累計分?jǐn)?shù)圖展示CDS區(qū)能夠明顯靶基因的差異改變倍數(shù)(圖E);這說明ac4C修飾主要發(fā)生在mRNA的CDS區(qū)。
圖4:acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析結(jié)果
ac4C修飾位點主要發(fā)生在mRNA CDS區(qū),那么是不是影響mRNA的翻譯呢?
(3)ac4C的功能探究
1)探究ac4C對mRNA的穩(wěn)定性的影響
為了探究ac4C修飾對mRNA的穩(wěn)定性的影響,作者做了BRIC-seq(主要用于檢測RNA半衰期)。BRIC-seq原理圖(圖A);在WT中,ac4C修飾和CDS能夠延長mRNA的半衰期,進一步說明能夠提高mRNA的穩(wěn)定性(圖B);下調(diào)NAT10能夠一直ac4C靶mRNA的穩(wěn)定性(圖C);作者又進一步通過BRIC-RT-qPCR低通量驗證,ac4C靶mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠明顯抑制ac4C靶mRNA的穩(wěn)定性,這與測序結(jié)果一致(圖E)。
圖5:ac4C修飾能夠促進mRNA的穩(wěn)定性
2)探究ac4C對mRNA的翻譯效率的影響
為了探究ac4C修飾對mRNA的翻譯效率的影響,作者做了Ribo-seq(核糖體測序)。Ribo-seq原理圖(圖B)。生信分析,在WT中,ac4C靶mRNA的的翻譯效率增強,下調(diào)NAT10后,ac4C靶mRNA的翻譯效率整體下降(圖C)。qPCR結(jié)果顯示,下調(diào)NAT10后,ac4C靶mRNA的RNA水平?jīng)]有明顯差異變化,但是在蛋白表達水平上是明顯降低的(圖D-F)。
圖6:ac4C修飾能夠促進mRNA的翻譯效率
(4)ac4C的機制探究
那么,ac4C是如何調(diào)控mRNA翻譯效率的呢?接下來作者進行了ac4C的分子機制探究。作者探究了mRNA密碼子的偏好性,并通過生信分析展示了乙?;揎椩诘?位堿基上的情況(圖A),并對其進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)乙?;揎椀腃出現(xiàn)在mRNA 密碼子的第3位具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖B);motif分析結(jié)果顯示在ac4C靶mRNA中的第3位堿基上,大多會出現(xiàn)發(fā)生乙?;腃(圖D-E)。
為了進一步進一步驗證ac4C對mRNA翻譯的影響,作者利用熒光素酶報告實驗(圖F),在報告質(zhì)粒中轉(zhuǎn)入發(fā)生修飾的C(ac4C(+))和同種突變的C(ac4C( )),體外轉(zhuǎn)錄后,轉(zhuǎn)入hela細胞中,分別用ac4C(+)和ac4C( )激活劑,檢測熒活性值,結(jié)果展示ac4C(+)能夠顯著提高mRNA的翻譯效率(圖G);裂解發(fā)生ac4C(+)和ac4C( )mRNA后,檢測熒光素活性值,發(fā)現(xiàn) ac4C靶mRNA中C的擺動性百分比顯著增強(圖H)。
圖7:ac4C通過密碼偏好性促進mRNA的翻譯效率
文章總結(jié)
本文總體架構(gòu)分三步走:首先從NAT10(唯一的RNA乙?;福┏霭l(fā),探究了酶的功能,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠抑制Hela細胞的增殖,下調(diào)mRNA ac4C修飾的整體水平;然后通過acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)ac4C修飾位點主要發(fā)生在mRNA的CDS區(qū);最后探究了ac4C的功能機制,發(fā)現(xiàn)ac4C通過堿基偏好性促進mRNA的翻譯效率。
圖8:ac4C通過密碼偏好性促進mRNA的翻譯效率
云序acRIP-seq技術(shù)服務(wù):
RNA乙?;庖吖渤恋?(acetylated RNA Immunoprecipitation,acRIP) 技術(shù):基于抗體特異性結(jié)合乙酰化修飾的堿基的原理,以RNA免疫共沉淀富集甲基化修飾片段為基礎(chǔ),然后通過高通量測序,在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究發(fā)生乙?;腞NA區(qū)域,高效獲得結(jié)果。
圖注:acRIP實驗及生信分析流程圖
云序acRIP-seq優(yōu)勢
分子全覆蓋
可全面檢測circRNA、LncRNA、mRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多類RNA分子ac4C乙?;稽c。
超微量技術(shù)
樣本低至500ng
系統(tǒng)性解決方案
提供acRIP乙酰化測序、rip測序 RNA pulldown等全套技術(shù)服務(wù),助力RNA乙酰化高分文章發(fā)表。
抗體富集效率高
acRIP-seq實驗采用預(yù)驗證的商業(yè)化抗體和精心優(yōu)化的實驗流程,具有極高的效率和特異性。
嚴(yán)格的質(zhì)控
acRIP-seq實驗每一步驟均設(shè)有關(guān)鍵質(zhì)控,全程監(jiān)控實驗質(zhì)量,保證優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)。
專業(yè)的生物信息學(xué)分析
云序生物擁有專業(yè)的生物信息分析團隊,幫助客戶進行實驗數(shù)據(jù)的全面挖掘。
RNA甲基化測序與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合應(yīng)用
整合RNA乙?;瘮?shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析,揭示RNA乙?;瘜虮磉_調(diào)控的影響,深入挖掘RNA乙酰化的功能。
acRIP-seq樣品要求
樣品類型
細胞、組織或RNA,其他樣本類型及樣品量請電詢。
樣品量
a)細胞: 2 107
b)組織:500mg - 1g
c) RNA:30 g - 300 g
d) 超微量滿足500ng - 30 g
云序生物RNA表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)特色:
云序作為一家依托于高通量測序的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)科研服務(wù)公司,長期致力于提供優(yōu)質(zhì)前沿表觀研究測序產(chǎn)品,繼m6A、m5C、m1A之后,云序隆重推出多款RNA新修飾,不僅ac4C RNA乙酰化測序,還包括m7G/m3C RNA甲基化測序、2 -氧-甲基化測序等產(chǎn)品,打造了全面的RNA修飾研究平臺。
云序,您身邊的表觀轉(zhuǎn)錄測序?qū)<遥?br>
m7G RNA 甲基化測序 m7G + m3C RNA甲基化測序 ac4C RNA乙酰化測序 2 -氧-甲基化測序 超微量m6A甲基化測序 m6A RNA甲基化測序 m5C RNA甲基化測序 m1A RNA甲基化測序 比色法檢測整體甲基化水平 RIP測序 RNA pull down 測序
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué) 的概念是通過轉(zhuǎn)錄后修飾影響RNA的結(jié)構(gòu)和功能,是近幾年來生物學(xué)科里熱門的研究領(lǐng)域之一,目前已知的天然RNA修飾類型超過150種,之前我們已經(jīng)介紹很多關(guān)于m6A、m5C、m1A和m7G的相關(guān)內(nèi)容。目前,ac4C RNA乙?;揎椬鳛橐活愋滦蚏NA修飾,是繼m6A修飾之后又一表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)熱點和 超級潛力股 !
ac4C RNA乙?;窃赗NA ac4C修飾酶的作用下,使N4位乙酰胞嘧啶發(fā)生乙?;囊环N保守的化學(xué)修飾(N4-acetylcytidine)。早期研究發(fā)現(xiàn)該修飾存在于真核生物中絲氨酸及亮氨酸t(yī)RNA和18S rRNA上,導(dǎo)致Watson-Crick堿基配合鳥苷的熱穩(wěn)定性增加,調(diào)控蛋白合成中的編碼準(zhǔn)確性;近期研究發(fā)現(xiàn)ac4C廣泛分布在人類轉(zhuǎn)錄組中,大多數(shù)位點出現(xiàn)在編碼序列(CDS)內(nèi),并且通過改善的mRNA穩(wěn)定性和翻譯促進靶基因表達。
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發(fā)表期刊:Cell
影響因子:36.22
實驗方法:acRIP-seq、RNA-seq等
技術(shù)線路
注:云序提供acRIP-seq和RNA-seq服務(wù)
文章內(nèi)容
(1)NAT10的功能探究
1)NAT10的細胞層面和分子層面表型探究
NAT10是RNA乙?;福瑸榱颂骄縍NA乙?;╝c4C)對RNA的結(jié)構(gòu)和功能的影響。作者首先探究了NAT10的功能。在Hela細胞中,下調(diào)NAT10后,發(fā)現(xiàn)能夠抑制細胞周期,抑制細胞的增殖能力(圖D和E)。為了進一步探究NAT10的功能,作者在siNC和siNAT10轉(zhuǎn)染的Hela細胞中做了RNA-seq,通過GO功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)差異mRNA與Hela細胞凋亡相關(guān)(圖G),這與前面的細胞表型結(jié)果是一致的。
圖1:NAT10在細胞和分子層面上功能探究
2)NAT10對mRNA ac4C修飾水平的影響
那么NAT10對mRNA ac4C修飾水平的影響是怎么樣的呢?作者通過HPLC方法,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠明顯降低mRNA ac4C的修飾水平(圖D)。
圖2:NAT10能夠影響mRNA ac4C的整體水平
(2)找NAT10的下游靶基因
ac4C RNA-seq和RNA-seq聯(lián)合分析:為了進一步探究NAT10對下調(diào)靶基因的調(diào)控,作者做了RNA 乙?;瘻y序(acRIP-seq)和RNA-seq,并進行生信分析
1)acRIP-seq結(jié)果展示
acRIP-seq測序方法(圖A);統(tǒng)計顯示有4,251個ac4C peaks(圖E);ac4C peak峰主要分布在mRNA的CDS區(qū)(圖H);靶mRNA的可視化結(jié)果,從左到右依次ac4C修飾高富集、中富集、無富集(圖F)。
圖3:acRIP-seq原理及部分生信分析結(jié)果
2)acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析結(jié)果展示
火山圖展示ac4C修飾隨下調(diào)的靶基因影響比較明顯(圖B);并且ac4C修飾主要發(fā)生在下調(diào)靶mRNA的CDS區(qū)(圖D);累計分?jǐn)?shù)圖展示CDS區(qū)能夠明顯靶基因的差異改變倍數(shù)(圖E);這說明ac4C修飾主要發(fā)生在mRNA的CDS區(qū)。
圖4:acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析結(jié)果
ac4C修飾位點主要發(fā)生在mRNA CDS區(qū),那么是不是影響mRNA的翻譯呢?
(3)ac4C的功能探究
1)探究ac4C對mRNA的穩(wěn)定性的影響
為了探究ac4C修飾對mRNA的穩(wěn)定性的影響,作者做了BRIC-seq(主要用于檢測RNA半衰期)。BRIC-seq原理圖(圖A);在WT中,ac4C修飾和CDS能夠延長mRNA的半衰期,進一步說明能夠提高mRNA的穩(wěn)定性(圖B);下調(diào)NAT10能夠一直ac4C靶mRNA的穩(wěn)定性(圖C);作者又進一步通過BRIC-RT-qPCR低通量驗證,ac4C靶mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠明顯抑制ac4C靶mRNA的穩(wěn)定性,這與測序結(jié)果一致(圖E)。
圖5:ac4C修飾能夠促進mRNA的穩(wěn)定性
2)探究ac4C對mRNA的翻譯效率的影響
為了探究ac4C修飾對mRNA的翻譯效率的影響,作者做了Ribo-seq(核糖體測序)。Ribo-seq原理圖(圖B)。生信分析,在WT中,ac4C靶mRNA的的翻譯效率增強,下調(diào)NAT10后,ac4C靶mRNA的翻譯效率整體下降(圖C)。qPCR結(jié)果顯示,下調(diào)NAT10后,ac4C靶mRNA的RNA水平?jīng)]有明顯差異變化,但是在蛋白表達水平上是明顯降低的(圖D-F)。
圖6:ac4C修飾能夠促進mRNA的翻譯效率
(4)ac4C的機制探究
那么,ac4C是如何調(diào)控mRNA翻譯效率的呢?接下來作者進行了ac4C的分子機制探究。作者探究了mRNA密碼子的偏好性,并通過生信分析展示了乙?;揎椩诘?位堿基上的情況(圖A),并對其進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)乙?;揎椀腃出現(xiàn)在mRNA 密碼子的第3位具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖B);motif分析結(jié)果顯示在ac4C靶mRNA中的第3位堿基上,大多會出現(xiàn)發(fā)生乙?;腃(圖D-E)。
為了進一步進一步驗證ac4C對mRNA翻譯的影響,作者利用熒光素酶報告實驗(圖F),在報告質(zhì)粒中轉(zhuǎn)入發(fā)生修飾的C(ac4C(+))和同種突變的C(ac4C( )),體外轉(zhuǎn)錄后,轉(zhuǎn)入hela細胞中,分別用ac4C(+)和ac4C( )激活劑,檢測熒活性值,結(jié)果展示ac4C(+)能夠顯著提高mRNA的翻譯效率(圖G);裂解發(fā)生ac4C(+)和ac4C( )mRNA后,檢測熒光素活性值,發(fā)現(xiàn) ac4C靶mRNA中C的擺動性百分比顯著增強(圖H)。
圖7:ac4C通過密碼偏好性促進mRNA的翻譯效率
文章總結(jié)
本文總體架構(gòu)分三步走:首先從NAT10(唯一的RNA乙?;福┏霭l(fā),探究了酶的功能,發(fā)現(xiàn)下調(diào)NAT10能夠抑制Hela細胞的增殖,下調(diào)mRNA ac4C修飾的整體水平;然后通過acRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)ac4C修飾位點主要發(fā)生在mRNA的CDS區(qū);最后探究了ac4C的功能機制,發(fā)現(xiàn)ac4C通過堿基偏好性促進mRNA的翻譯效率。
圖8:ac4C通過密碼偏好性促進mRNA的翻譯效率
云序acRIP-seq技術(shù)服務(wù):
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圖注:acRIP實驗及生信分析流程圖
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整合RNA乙?;瘮?shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析,揭示RNA乙?;瘜虮磉_調(diào)控的影響,深入挖掘RNA乙酰化的功能。
acRIP-seq樣品要求
樣品類型
細胞、組織或RNA,其他樣本類型及樣品量請電詢。
樣品量
a)細胞: 2 107
b)組織:500mg - 1g
c) RNA:30 g - 300 g
d) 超微量滿足500ng - 30 g
云序生物RNA表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)特色:
云序作為一家依托于高通量測序的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)科研服務(wù)公司,長期致力于提供優(yōu)質(zhì)前沿表觀研究測序產(chǎn)品,繼m6A、m5C、m1A之后,云序隆重推出多款RNA新修飾,不僅ac4C RNA乙酰化測序,還包括m7G/m3C RNA甲基化測序、2 -氧-甲基化測序等產(chǎn)品,打造了全面的RNA修飾研究平臺。
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