隨著熒光檢測的普及，許多科研人員將western blot的檢測方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒狻＿@是因為熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標(biāo)蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。另外，熒光的好處在于動態(tài)范圍更寬、信號穩(wěn)定性更好。

為了讓你的實驗過程能輕松+成功，深藍(lán)云生物研發(fā)部的專家們?yōu)槲覀儙砹艘恍晒鈝estern blot的小貼士。
 

★ 熒光Western Blot基礎(chǔ)知識 ★

熒光western blot可以進(jìn)行多重檢測并生成可定量的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)滿足期刊雜志對于數(shù)據(jù)發(fā)表的要求。熒光檢測解決了化學(xué)發(fā)光檢測所面臨的一些局限性，例如：數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，半定量，動態(tài)范圍等問題。所以熒光Western blot變得越來越流行。對于需要更復(fù)雜的信號線性分析和蛋白豐度相關(guān)性的研究人員來說，熒光方法是一個很好的選擇。 

一旦你決定使用熒光數(shù)字成像系統(tǒng)，下一步就是仔細(xì)考慮印跡試劑了。高品質(zhì)，低熒光膜是熒光Western blotting的首選。也需要優(yōu)化封閉液和漂洗液，提供更好的解決方案。小伙伴在從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)換到熒光檢測時遇到的最大問題之一是高背景。使用正確的膜，以及封閉液和漂洗液，將確保你開始正確的熒光western實驗。在轉(zhuǎn)印過程中，關(guān)鍵是要使用一種不會產(chǎn)生太多熱量的協(xié)議。高溫會導(dǎo)致背景升高，特別是在可見熒光檢測中。因此，在不產(chǎn)生過多熱量的緩沖液中，短時間內(nèi)進(jìn)行濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)是理想的選擇。

最后和最具挑戰(zhàn)性的試劑選擇是熒光二抗的選擇。幸運的是，隨著熒光檢測方法的日益普及，市場上有大量的商品化的熒光二抗可供選擇。在選擇抗體染料偶聯(lián)物之前，了解成像系統(tǒng)每個通道的激發(fā)波長和發(fā)射波長是很重要的。一旦了解了這些信息，您就可以選擇與您的系統(tǒng)最兼容的染料。

如何提高熒光western blot檢測效果

★  用滴定法測定一抗和二抗的原始濃度。

★  多重檢測之前，先分別對目的蛋白和內(nèi)參進(jìn)行優(yōu)化。

★  一抗的使用濃度要高于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光的2-5X。二抗的濃度也需要增加，一般建議使用的初始稀釋度是1:5000。

★  使用低背景的PVDF 膜。NC 膜和一些PVDF 自發(fā)熒光較高， 引起高背景。

★  避免標(biāo)記和染料本身產(chǎn)生的熒光。使用鉛筆標(biāo)記印跡膜。例如溴酚藍(lán)和考馬斯亮藍(lán)都有自發(fā)熒光。

★  保持潔凈，在使用前對托盤等設(shè)備進(jìn)行清洗，戴手套處理凝膠，用鑷子處理膜。

★  熒光抗體要避光保存，防止發(fā)生淬滅現(xiàn)象，影響抗體的使用。

★  當(dāng)進(jìn)行多重檢測的時候，染料要避免重疊，選擇光譜距離較遠(yuǎn)的染料進(jìn)行孵育。

★  想要保存印跡膜，需要將其避光保存。

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