EvaGreen 是一種無致突變性、無細(xì)胞毒性的DNA結(jié)合染料,NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)可兼容EvaGreen 染料進(jìn)行的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)分析。
反應(yīng)體系中游離的的EvaGreen 染料不發(fā)出熒光信號(hào),但與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合后會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光。NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)使用檢測(cè)參比熒光(熒光素鈉鹽)相同的濾光片可進(jìn)行EvaGreen 染料熒光信號(hào)的檢測(cè)。
使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng),EvaGreen 可以通過使用簡(jiǎn)單的引物來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)絕對(duì)定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen 的方法可檢測(cè)低至0.2copies/ L。
圖1:基于EvaGreen 染料方法的基因組DNA絕對(duì)定量
對(duì)未進(jìn)行片段化的人基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋,濃度范圍從1000-0.2copies/ L,使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對(duì)定量,使用1.5XEvaGreen ,1XPerfeCTa @ UNG Tough mix,擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重復(fù)性和穩(wěn)定性我們進(jìn)行了三次重復(fù)(R2= 0.9977)。在NTC(無模板對(duì)照)孔中沒有觀察到陽性微滴。
當(dāng)使用EvaGreen 方法進(jìn)行數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)時(shí),需要注意,加入PCR mix的模板dsDNA濃度過高將導(dǎo)致較高的背景熒光。此外,EvaGreen 染料與dsDNA具有較高的親和力,但同時(shí)也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力,導(dǎo)致背景熒光的增加。
根據(jù)您所需定量的DNA類型和數(shù)字PCR反應(yīng)體系,需要預(yù)估實(shí)際的動(dòng)態(tài)范圍。
圖2:EvaGreen 絕對(duì)定量散點(diǎn)圖
對(duì)未片段化的人類的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋后,濃度范圍1000-0.2copies/ L,使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對(duì)定量,使用1.5XEvaGreen ,1XPerfeCTa @ UNG Tough mix,擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。
灰色點(diǎn):陰性微滴,藍(lán)色點(diǎn):陽性微滴。
RFU:相對(duì)熒光強(qiáng)度。