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Life Tech產(chǎn)品Ion Proton、Ion PGM的使用體驗(yàn)——來自Baylor HGSC中心

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-03-05  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):377
Life Tech產(chǎn)品Ion Proton、Ion PGM的使用體驗(yàn)——來自Baylor HGSC中心

作者:Julia Karow

Baylor醫(yī)學(xué)院人類基因組測序中心(HGSC)經(jīng)過對Life Technologies的Ion Proton?平臺的廣泛測試,迄今為止已經(jīng)完成了360多次運(yùn)行,并且將其在外顯子組測序中的表現(xiàn)與Illumina技術(shù)進(jìn)行了比較。另外,它還針對Ion PGM?開發(fā)了多個(gè)應(yīng)用,PGM?目前已進(jìn)入數(shù)據(jù)生產(chǎn)線。

本月早期在冷泉港實(shí)驗(yàn)室召開的個(gè)人基因組和醫(yī)學(xué)基因組學(xué)會議上,HGSC的運(yùn)營主管Donna Muzny詳細(xì)介紹了該中心使用這兩個(gè)平臺的體驗(yàn)。

Baylor HGSC目前擁有16臺Illumina HiSeq、兩臺Illumina MiSeq、四臺Ion Proton?、四臺Ion PGM?、三臺羅氏/454儀器,一臺PacBio RS以及若干臺Sanger測序儀。

Proton?的測試版于今年4月在該中心開始使用,并在9月升級到了商業(yè)版。截至11月中旬,該中心已在Proton?上完成了360多次運(yùn)行。最初用于測試一系列標(biāo)準(zhǔn)微生物、哺乳動物的BAC,以及來自人類HapMap樣品和靈長類動物的文庫。

上個(gè)月,該中心開始利用改進(jìn)型磁珠在Proton?上測試了200 bp的讀取,這些磁珠預(yù)計(jì)在12月份正式發(fā)售。它們的結(jié)合性能更佳,因此支持更長的文庫并連接更多的模板。Muzny在報(bào)告中稱,它們還能改善數(shù)據(jù)質(zhì)量,使比對后的Q20堿基增加三倍。因此,HGSC目前每次運(yùn)行實(shí)現(xiàn)了9-10 Gb的比對數(shù)據(jù),包括最近一次11.5 Gb的運(yùn)行。她談道,該平臺如今能在22小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生比對數(shù)據(jù),運(yùn)行時(shí)間僅為4小時(shí)。

最近,研究人員還評估了Proton在外顯子組測序上的表現(xiàn),并就同一個(gè)樣品的結(jié)果與Illumina的HiSeq平臺進(jìn)行了比較。

在比較中,他們對一名之前測序過的患有腓骨肌萎縮癥個(gè)體的外顯子組進(jìn)行了測序,分別采用的是Baylor基于NimbleGen的VCRome 2.1外顯子組捕獲設(shè)計(jì)、Proton? PI芯片和200 bp讀取。運(yùn)行產(chǎn)生了8.7 Gb比對數(shù)據(jù),平均覆蓋度為91x,且92%目標(biāo)堿基的覆蓋度至少為20x。

兩個(gè)平臺產(chǎn)生的結(jié)果大幅重疊:94%的高質(zhì)量單核苷酸變異在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都檢出,但實(shí)驗(yàn)室未檢測插入缺失的重疊。重要的是,Proton?也同樣鑒定出了兩個(gè)致病突變——正是Baylor科學(xué)家之前發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的。

Muzny表示,該中心2013年的目標(biāo)是在Proton?平臺上產(chǎn)生臨床級別的外顯子組。

Baylor HGSC還擁有四臺Ion PGM?。他們在2011年1月開始運(yùn)行該平臺,并在大約一年前轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)模式,主要運(yùn)行在擴(kuò)增子和區(qū)域捕獲測序應(yīng)用。

該中心目前利用318芯片和300 bp讀取,在PGM?上每次運(yùn)行能產(chǎn)生超過1 Gb的數(shù)據(jù)。應(yīng)用范圍包括擴(kuò)增子測序、線粒體基因組測序、區(qū)域捕獲測序、外顯子組測序,以及16S宏基因組測序和mate-pair文庫測序,用于結(jié)構(gòu)變異檢測。

與此同時(shí),Baylor還利用Ion Torrent?標(biāo)準(zhǔn)的文庫操作和貝克曼庫爾特的Biomek FXp雙臂機(jī)器人將PGM?的文庫構(gòu)建自動化,,并開發(fā)出Ion Torrent?特異的單核苷酸變異檢出程序,命名為VarIONt。

PGM?上擴(kuò)增子測序的應(yīng)用之一是驗(yàn)證其他測序平臺所發(fā)現(xiàn)的變異。Muzny稱,僅在上兩個(gè)月,他們就在PGM?上驗(yàn)證了4000多個(gè)來自癌癥項(xiàng)目的變異位點(diǎn)。

而擴(kuò)增子測序的另一個(gè)應(yīng)用是疾病發(fā)現(xiàn)。例如,該中心已篩查了約50個(gè)人的一個(gè)大基因,它與某種形式的心肌病有關(guān),在9名受試者中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)有害突變。

此外,HGSC還在PGM?上嘗試了線粒體基因組測序分析,目前Baylor的全基因組實(shí)驗(yàn)室是在Illumina平臺上運(yùn)行的。該分析利用長距離PCR,當(dāng)變異存在于至少10%的讀取時(shí),它可以檢測線粒體異質(zhì)性。

為了驗(yàn)證該分析,Baylor將PGM?上產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與Illumina MiSeq的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較,兩者均采用 Proton?比較時(shí)的腓骨肌萎縮癥樣本。長距離PCR反應(yīng)需要10 ng起始DNA,而文庫構(gòu)建需要1 μg PCR產(chǎn)物。Muzny表示,PGM和MiSeq都發(fā)現(xiàn)了31個(gè)相同的線粒體變異,但PGM?還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)MiSeq漏掉的真正變異,而MiSeq的數(shù)據(jù)還包含三個(gè)假陽性變異。在其他五個(gè)之前分析過的患者樣本中,PGM?也發(fā)現(xiàn)了所有的已知疾病突變。

最近,Baylor的研究小組正在為PGM?開發(fā)區(qū)域捕獲設(shè)計(jì)以及外顯子組測序。其中的優(yōu)化步驟包括將文庫構(gòu)建的DNA起始量降低到1 μg,以及文庫制備過程的其他改變。

到目前為止,Baylor已經(jīng)設(shè)計(jì)出多個(gè)區(qū)域捕獲panel,大小在0.1-7 Mb,適用于視網(wǎng)膜疾病、血栓形成和部分X染色體。Baylor還在PGM?上評估了VCRome 2.1全外顯子組設(shè)計(jì)。

就PGM?的運(yùn)行成本而言,Muzny認(rèn)為該平臺目前比羅氏454“便宜多了”,與Illumina MiSeq“不相上下”。


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