寫在首個(gè)數(shù)字PCR平臺(tái)獲批美國FDA之際。

本文作者為伯樂生命醫(yī)學(xué)大中華區(qū)LSG產(chǎn)品經(jīng)理趙云。

趙云 伯樂生命醫(yī)學(xué)大中華區(qū)LSG產(chǎn)品經(jīng)理

2019年2月14日，Bio-Rad 公司的QXDx AutoDG ddPCR系統(tǒng)及QXDx BCR-ABL%IS 試劑盒成為業(yè)內(nèi)第一個(gè)獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的數(shù)字PCR產(chǎn)品，510 (K) Number: K181661。這也使得Bio-Rad的微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)平臺(tái)成為業(yè)內(nèi)目前唯一同時(shí)獲得歐洲CE-IVD和美國FDA許可的數(shù)字PCR設(shè)備；如果繼續(xù)獲得中國NMPA的三類醫(yī)療器械注冊(cè)，那么Bio-Rad的ddPCR技術(shù)設(shè)備將可以率先叩開全球主要國家和地區(qū)IVD市場(chǎng)的大門。據(jù)悉Bio-Rad QX200 ddPCR平臺(tái)在中國的IVD注冊(cè)工作也已處于臨床試驗(yàn)階段。

Bio-Rad QXDx AutoDG ddPCR系統(tǒng)

數(shù)字PCR是核酸定量檢測(cè)方法的巨大飛躍

數(shù)字PCR沿襲了qPCR熒光化學(xué)原理，但數(shù)字PCR對(duì)靶標(biāo)核酸的定量卻采用了完全不用的數(shù)學(xué)原理和方技術(shù)方法。其核心思想是使樣本中的核酸分子在若干獨(dú)立微反應(yīng)單元中隨機(jī)分裝和擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行各反應(yīng)單元的熒光信號(hào)檢測(cè)，沒有qPCR那樣的實(shí)時(shí)熒光信號(hào)讀取的過程。方法學(xué)的本質(zhì)差異使得數(shù)字PCR具有更高靈敏度、重復(fù)和可靠性，而且摒棄了對(duì)外部參照和標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的依賴。

毫無疑問，數(shù)字PCR是核酸定量檢測(cè)方法上的巨大飛躍。但曾幾何時(shí)，理念的過于超前、操作太過繁雜、使用成本高，讓數(shù)字 PCR 在發(fā)展的道路上一度躑躅不前。直至新技術(shù)新思路的提出，特別是乳液PCR和微流控技術(shù)的融入，才使得數(shù)字 PCR 完成了從概念到成熟技術(shù)平臺(tái)的轉(zhuǎn)化，并成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。而這其中，Bio-Rad 微滴式數(shù)字PCR無疑是行業(yè)翹楚。

腫瘤液體活檢是精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展的必然選擇

可以這樣說，ddPCR的臨床應(yīng)用價(jià)值也是伴隨腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療理念的提出以及在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中推行的過程中逐漸被認(rèn)知的。

當(dāng)前的醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，對(duì)大多數(shù)實(shí)體腫瘤遺傳狀態(tài)的分析是建立在侵入性手段獲取的腫瘤組織樣本上。由于取樣方式的傷害性，或者晚期癌癥病人的狀態(tài)不佳，又或某些癌癥的特殊性，使得組織樣本并不總是可以獲得的樣本，連續(xù)獲取組織樣本更加不切實(shí)際。

然而精準(zhǔn)醫(yī)療方案的制定和調(diào)整必須了解腫瘤遺傳狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，又需要對(duì)病人重復(fù)取樣。因此腫瘤的液體活檢應(yīng)運(yùn)而生，成為臨床中精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展的必然選擇，并且成為行業(yè)的一次重要技術(shù)和理念的升級(jí)。而ddPCR的推出，應(yīng)該說恰逢其時(shí)。

這是因?yàn)橐后w活檢本質(zhì)上是為了解決兩個(gè)問題：樣本來源和檢測(cè)手段的問題。液體活檢采用非侵入式方法獲得血液及其他體液樣本，可供檢測(cè)的腫瘤來源的分子標(biāo)志物包括ctDNA、cfRNA、非編碼RNA、外泌體等，尤其是以ctDNA為樣本對(duì)腫瘤相關(guān)的CNV/SNV、indel、表觀遺傳標(biāo)志物進(jìn)行分析，在當(dāng)前的臨床實(shí)踐中得到推行。

然而ctDNA豐度低，且樣本中還存在高豐度的野生型背景干擾，要穩(wěn)定可靠地檢出微小序列變異，談何容易? 因此，穩(wěn)定可靠地施行基于ctDNA的液體活檢，對(duì)檢測(cè)手段的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了更高的要求。

定性到定量——腫瘤檢測(cè)的發(fā)展路徑

盡管qPCR已在IVD領(lǐng)域得到了非常廣泛應(yīng)用，然而在液體活檢方面，基于qPCR的COBAS、ARMS以及Super-ARMS的檢測(cè)靈敏度卻要低于ddPCR。有國內(nèi)外的系統(tǒng)研究表明，對(duì)于血漿中的EGFR T790M突變的檢測(cè)，ddPCR相比qPCR方法有更高的靈敏度[1,2,3],有助于篩選出更多可能受益的病人。理論上，ddPCR可以穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)0.1%-0.001%的檢測(cè)靈敏度，這很大程度上有賴于可用于檢測(cè)分析的臨床樣本的量。舉例來說，如果能獲得100ng cfDNA，理論上ddPCR可穩(wěn)定達(dá)到0.01%的檢測(cè)靈敏度。

ddPCR的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是對(duì)腫瘤標(biāo)志物的絕對(duì)定量以及更好的數(shù)據(jù)重復(fù)性和再現(xiàn)性。這對(duì)于監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，為療效的評(píng)估以及疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)提供量化的數(shù)據(jù)意義重大。此外，對(duì)于提示耐藥的標(biāo)志物的定量檢測(cè)(豐度百分比)，也有助于進(jìn)一步篩選出含有低豐度耐藥突變，仍可受益于治療的病人，而不是簡單的以陽性或陰性進(jìn)行判斷。

相信腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)會(huì)有一個(gè)從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)，從定性到定量的發(fā)展過程。

總的來說，基于ddPCR的液體活檢，可克服腫瘤組織異質(zhì)性對(duì)腫瘤進(jìn)行分子分型，還可對(duì)疾病進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測(cè)，實(shí)現(xiàn)療效實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和評(píng)估，還包括對(duì)微小殘留病檢測(cè)。ddPCR對(duì)于已知用藥意義的腫瘤分子標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量檢測(cè)，為腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療提供信息和依據(jù)，參與腫瘤病人的全程管理。

ddPCR技術(shù)趨于成熟，臨床應(yīng)用已完成起步

在筆者看來，qPCR已經(jīng)是非常成熟的技術(shù)，而ddPCR正處于快速增長的起步階段。從技術(shù)的視角上看，ddPCR在液體活檢的應(yīng)用已經(jīng)基本完成了起步，現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入到接受市場(chǎng)和臨床實(shí)踐的冷靜思考和評(píng)判期，而這應(yīng)該被看作是ddPCR技術(shù)趨于成熟的表現(xiàn)，或者說是ddPCR走向成熟的必經(jīng)階段。

產(chǎn)品生命周期

ddPCR未來需要開展的工作，一方面是基于ddPCR的液體活檢流程的統(tǒng)一化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，以及在臨床應(yīng)用準(zhǔn)入資格的獲得；另一方面，在科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究基礎(chǔ)上，確認(rèn)基于ddPCR的檢測(cè)方法在不同IVD細(xì)分領(lǐng)域下的的臨床有效性、實(shí)用性；同時(shí)更多的臨床診斷試劑盒的廠家的積極介入，更快的推動(dòng)ddPCR應(yīng)用的深度和廣度上的發(fā)展。

事實(shí)上自商業(yè)化以來，數(shù)字PCR技術(shù)特別微滴式數(shù)字PCR技術(shù)獲得了快速發(fā)展。按照Markets and Markets的分析預(yù)測(cè)，全球qPCR和dPCR市場(chǎng)的年復(fù)合增長率有望將達(dá)到8.9%，到2022年達(dá)到5.31億美元的市場(chǎng)容量，并且預(yù)計(jì)dPCR的增長將超過qPCR。盡管數(shù)字PCR的市場(chǎng)開發(fā)任重道遠(yuǎn)，但FDA的批準(zhǔn)，無疑是ddPCR技術(shù)加快進(jìn)入臨床應(yīng)用的重要起點(diǎn)，也是數(shù)字PCR行業(yè)快速發(fā)展的重要切入點(diǎn)。

參考資料

1. Wenxian Wang, Zhengbo Song, and Yiping Zhang. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR‐TKI resistance. Cancer Med. 2017 Jan; 6(1): 154–162.

2. Buder, A., Setinek, U., Hochmair, M.J. et al. Targ oncol (2019). https://doi.org/10.1007/s11523-019-00623-x.

3. 曹紫陽，吳偉，侯立坤，張偉，高彩霞，武春燕，張莉萍。微滴數(shù)字PCR與Super-ARMS PCR檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥后血漿游離DNA EGFR 基因T790M突變的對(duì)比分析。中華病理學(xué)雜志 2018年12月第47卷第12期。

4. https://www.marketsandmarkets.com/PressReleases/digital-pcr.asp

注：

ddPCR平臺(tái)目前在中國大陸僅限于科研使用，不作為臨床診斷。

Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區(qū)域的商標(biāo)。