色譜儀作為復(fù)雜物質(zhì)的分離工具，在日?；衔锏姆蛛x分析中發(fā)揮了巨大的作用，多數(shù)色譜儀屬于一維色譜，適合于含幾十至幾百個(gè)物質(zhì)的樣品分析。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，傳統(tǒng)的一維色譜分離方式已經(jīng)不能滿足人們對(duì)諸如天然產(chǎn)物、中藥藥物和蛋白質(zhì)組等的常規(guī)分離，迫切需要更高效的分離方式來(lái)完成復(fù)雜樣品精細(xì)分離的需要。因此，能夠提供更大峰容量和更高分辨率的多維色譜技術(shù)日益受到人們的關(guān)注。相對(duì)于一維色譜分離而言，多維色譜分離具有更高的峰容量。從本質(zhì)上說(shuō)，多維色譜就是簡(jiǎn)單的一維色譜加復(fù)雜的閥切換技術(shù)。

　　目前，發(fā)展速度較快的多維色譜技術(shù)包括：全二維氣相色譜、多維高效液相色譜、高效液相—毛細(xì)管電泳多維色譜、高效液相—?dú)庀喽嗑S色譜和多維超臨界流體色譜等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有些儀器公司陸續(xù)推出了一些多維色譜儀，但主要是二維色譜儀。例如島津、沃特世、SCIEX、安捷倫和賽默飛等，其中賽默飛和SCIEX推出的二維液相色譜儀主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組的分析。安捷倫和沃特世推出的二維液相色譜儀，其使用主要集中在藥物小分子的篩選。在已商品化的全二維氣相色譜中，LECO 全二維氣相色譜結(jié)合chromaTOF 軟件，一次可解析大于100000個(gè)峰，降低了研究領(lǐng)域的譜峰解析難度。同時(shí)，國(guó)內(nèi)色譜專家在陣列多維色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用上也有了杰出的研究成果。

　　近期，儀器信息網(wǎng)編輯就多維色譜目前發(fā)展?fàn)顩r、技術(shù)優(yōu)勢(shì)及未來(lái)產(chǎn)業(yè)化前景等內(nèi)容與國(guó)內(nèi)較早開(kāi)始研究多維色譜技術(shù)的復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系張祥民教授進(jìn)行了深入的交流。

　　多維色譜破解蛋白組學(xué)研究密碼

　　多維色譜技術(shù)包括二維色譜、三維色譜等高維色譜，近年來(lái)其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。張祥民介紹，多維色譜不是簡(jiǎn)單的將每個(gè)柱子接起來(lái)。多維色譜指的是第一維分離出來(lái)數(shù)十到上百個(gè)餾分后，第二維相當(dāng)于把第一維做出來(lái)的每個(gè)餾分再重新做一遍，以此類推。例如汽油，一維色譜可以分出來(lái)三、四百個(gè)組分，兩維色譜其組分可以達(dá)數(shù)千，有學(xué)者曾用三維色譜去分，其組分可達(dá)六千多個(gè)。起初，張祥民教授團(tuán)隊(duì)提出用多維色譜技術(shù)來(lái)做中藥成分分析。由于中藥成分較為復(fù)雜，其中活性成分較難確定。通過(guò)多維色譜和高效毛細(xì)管電泳的結(jié)合，可以將中藥里上千個(gè)餾分分離出來(lái)，這樣就可以很好的鑒別不同中藥里組分的活性和差異。復(fù)旦大學(xué)是最早建立多維色譜儀器系統(tǒng)并作為新技術(shù)手段用于解決實(shí)際問(wèn)題的單位之一，這主要得益于復(fù)旦大學(xué)良好的儀器研發(fā)基礎(chǔ)。

　　20世紀(jì)90年代，作為功能基因組學(xué)的重要支柱——蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，使得多維色譜的研究成為新的研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組傳統(tǒng)的研究方法是采用雙向凝膠電泳分析。在雙相凝膠電泳分析中，一維用來(lái)跑等電聚焦，另一維用來(lái)跑分子量，兩維組合起來(lái)就可以將蛋白點(diǎn)分離出來(lái)。蛋白質(zhì)組剛出來(lái)時(shí)幾乎都在用這個(gè)方法做。雙相凝膠電泳雖然可以分離出來(lái)幾千個(gè)蛋白組分，但其工作量較大，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。張祥民談到，起初其復(fù)旦大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)使用雙向電泳凝膠技術(shù)鑒定人肝中的蛋白質(zhì)，團(tuán)隊(duì)三十幾個(gè)人需要花費(fèi)一兩個(gè)月才能鑒定兩千多個(gè)蛋白出來(lái)，過(guò)程中耗費(fèi)了大量的人力和物力?，F(xiàn)在采用多維色譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離鑒定一個(gè)人僅需要幾個(gè)小時(shí)可鑒定5000-8000個(gè)蛋白，而且花費(fèi)僅為數(shù)千元。多維色譜技術(shù)的突破迅速推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)難題的解決，例如重大疾病和各種癌癥中的重大技術(shù)瓶頸問(wèn)題。通過(guò)采用多維色譜技術(shù)可以尋找到一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子、疾病標(biāo)志物和藥靶蛋白，從而實(shí)現(xiàn)臨床上的疾病診斷和新的治療藥物的發(fā)現(xiàn)。

　　目前，多維液相色譜技術(shù)已廣泛的運(yùn)用到由小分子到大分子的分離分析中，其商品化的色譜儀器日益完善。同時(shí)，研制我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵設(shè)備，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的分離分析方法已成為當(dāng)下值得關(guān)注的焦點(diǎn)之一，也是提高我國(guó)科技能力的一個(gè)重要方面。現(xiàn)階段，盡管新技術(shù)新方法不斷涌現(xiàn)，但是還不能完全滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，尤其是缺少蛋白質(zhì)組學(xué)中核心技術(shù)設(shè)備和應(yīng)用于臨床疾病研究的創(chuàng)新技術(shù)方法。然而，隨著多維色譜分離技術(shù)的提高，分離方法不斷進(jìn)步，具有高通量高分離能力的多維色譜必將在蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

　　國(guó)內(nèi)多維色譜研究的開(kāi)創(chuàng)者

　　張祥民于1986年進(jìn)入中科院大連化學(xué)物理研究所工作，師從盧佩章院士和張玉奎院士。1994年張祥民進(jìn)入復(fù)旦大學(xué)，從事博士后研究工作，后留復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系工作至今。目前，張祥民為復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系和復(fù)旦生物醫(yī)學(xué)研究院雙聘教授。還歷任中國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)理事、中國(guó)化學(xué)會(huì)色譜專業(yè)委員會(huì)委員、中國(guó)色譜學(xué)會(huì)常務(wù)理事、中國(guó)分析儀器學(xué)會(huì)常務(wù)理事、中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)理事、上海市分析測(cè)試協(xié)會(huì)副理事長(zhǎng), 并擔(dān)任Proteomics, Anal Bioanal Chem (ABC)和《色譜》雜志編委等。

　　張祥民課題組是國(guó)內(nèi)最早開(kāi)始研究多維色譜技術(shù)的團(tuán)隊(duì)之一，其多項(xiàng)有關(guān)多維色譜技術(shù)的論文發(fā)表在國(guó)內(nèi)外高水平的期刊雜志上。目前，張祥民課題組主要依托于復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系、生物醫(yī)學(xué)研究院和教育部創(chuàng)新科學(xué)儀器工程研究中心，課題組實(shí)驗(yàn)室共有三十余名科研人員從事多維色譜技術(shù)的研究。迄今為止，張祥民課題組累計(jì)發(fā)表SCI論文230多篇，申請(qǐng)發(fā)明專利50多項(xiàng)，獲得2項(xiàng)教育部自然科學(xué)獎(jiǎng)。

復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系和復(fù)旦生物醫(yī)學(xué)研究院雙聘教授張祥民

　　從原理上對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)發(fā)起挑戰(zhàn)

　　目前，國(guó)內(nèi)分析儀器企業(yè)與國(guó)外公司相比體量還比較小，主要提供的是中低端儀器和量大面廣的產(chǎn)品。因此，國(guó)內(nèi)分析儀器生產(chǎn)企業(yè)對(duì)新型的儀器研發(fā)投入熱情很高，但也存在心有余力不足的局面。上海市科委從“十五”到“十二五“一直對(duì)分析儀器行業(yè)有持續(xù)的資金投入，張祥民教授課題組參與承擔(dān)了一系列儀器攻關(guān)項(xiàng)目研究，與企業(yè)開(kāi)展產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合開(kāi)發(fā)，先后與上海精科、舜宇恒平、上海天美等儀器公司合作，研發(fā)了十多種新型分析儀器，取得了一批創(chuàng)新技術(shù)成果。近年來(lái)國(guó)家開(kāi)始逐步加大對(duì)國(guó)內(nèi)分析儀器研發(fā)的支持力度，特別是“十二五“期間一些國(guó)家重大科學(xué)儀器開(kāi)發(fā)專項(xiàng)資金的投入力度很大，一改研發(fā)資金不足的處境，這些資金的投入已經(jīng)產(chǎn)出了大批先進(jìn)的儀器和制造技術(shù)，相信國(guó)內(nèi)分析儀器未來(lái)在儀器研發(fā)和創(chuàng)新上會(huì)有很大的發(fā)展和突破。張祥民談到，“我們起初研發(fā)色譜儀器的想法很簡(jiǎn)單，主要是基于前沿研究課題需要和一些生產(chǎn)實(shí)際過(guò)程中的急需。因?yàn)樯唐穬x器不能滿足要求，在沒(méi)有充足的購(gòu)置經(jīng)費(fèi)時(shí)，創(chuàng)新便成為必要的選項(xiàng)。然而，創(chuàng)新色譜儀器的研制也不是想象的那么復(fù)雜，設(shè)計(jì)原理新、技術(shù)方案簡(jiǎn)單、成本低是前提，于是就根據(jù)需要自己搭建一套?！?p>　　發(fā)明的熱膨脹泵就是典型的案例之一。色譜泵是色譜儀中運(yùn)動(dòng)部件最多，機(jī)械磨損最嚴(yán)重、較容易出故障的設(shè)備。色譜泵作為色譜儀的核心部件，其性能的好壞直接影響整個(gè)儀器和分離的可靠性。張祥民課題組研發(fā)的全新色譜泵——微流高壓梯度熱膨脹泵，采用一種全新的原理，其樣機(jī)已成功應(yīng)用于高效毛細(xì)管液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀器中，并得到安捷倫等國(guó)際企業(yè)研發(fā)機(jī)構(gòu)的關(guān)注。由于液體具有熱脹冷縮的特點(diǎn)，當(dāng)溫度升高時(shí)，毫升級(jí)密閉加熱腔內(nèi)液體體積就會(huì)有納升到微升級(jí)的微小膨脹，從而溢出密閉加熱腔，實(shí)現(xiàn)流量輸出。熱膨脹泵是以密閉腔體內(nèi)液體受熱體積膨脹為驅(qū)動(dòng)力，從而實(shí)現(xiàn)流體定向輸出。張祥民談到，熱膨脹泵的特別之處在于：從原理上還沒(méi)有相關(guān)的商品化儀器。根據(jù)得到的理論方程，熱膨脹泵只要精密控制好其溫度和升溫方式就可以保證過(guò)程中流量的恒流輸出。熱膨脹泵最大的優(yōu)勢(shì)是整機(jī)中幾乎沒(méi)有機(jī)械運(yùn)動(dòng)的部件，運(yùn)行中聽(tīng)不到任何噪聲，但其輸出的壓力卻可以很高，可達(dá)到100 MPa。同時(shí)，熱膨脹泵可以很好的避免傳統(tǒng)泵中活塞桿、單向閥和密封環(huán)等部件在系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中損耗產(chǎn)生的費(fèi)用，其成本比傳統(tǒng)色譜儀低3~5倍。

　　“陣列”與“多維”的完美結(jié)合

　　陣列多維色譜儀研制的想法源于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的需要，是為實(shí)驗(yàn)而服務(wù)的。陣列多維色譜儀中的“陣列”代表著多通道和同時(shí)分離。2003年復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)組研究團(tuán)隊(duì)購(gòu)買了一臺(tái)最快的TOF-TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，其激光打譜的頻率可以達(dá)到每秒兩百?gòu)垐D，傳統(tǒng)的多維色譜分離速度明顯跟不上該儀器對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定需求。張祥民談到，傳統(tǒng)多維色譜遇到的最大問(wèn)題是分析樣品速度較慢，盡管目前已有超高壓液相色譜，但總體來(lái)說(shuō)分離速度還是受到限制。例如，從第一維色譜中分離出100個(gè)組分，如果每個(gè)組分分離需要1小時(shí)，那么第二維分離將達(dá)到100小時(shí)，時(shí)間太長(zhǎng)。如果將多維色譜后一維做成陣列式，那么儀器運(yùn)行過(guò)程就可以平行進(jìn)行，從而使得效率成倍增加?；诖?，張祥民課題組研制了一臺(tái)18通道的陣列多維色譜儀，其分離速度提高18倍，可以與飛行時(shí)間質(zhì)譜儀很好的進(jìn)行匹配，大大縮短了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的分析時(shí)間。

圖1. 陣列式多維液相色譜分離系統(tǒng)工作原理圖。詳見(jiàn)Anal. Chem. 2016, 88,2440-2445和《分析化學(xué)》 2015, 43: 1472-1478。(1) HPLC梯度泵;；（2）六通閥；(3)第一維分離柱；(4)紫外檢測(cè)器；(5) 10通道順序切換閥；(6）三通；（7）第二維陣列預(yù)柱；（8）8通道分流器；（9）第二維陣列分離柱；（10）96孔板。

　　目前，陣列多維色譜儀技術(shù)瓶頸問(wèn)題已經(jīng)得到解決。其中的關(guān)鍵技術(shù)已經(jīng)在團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的國(guó)家973項(xiàng)目和國(guó)家863專項(xiàng)的實(shí)施過(guò)程中得到全面的發(fā)展、完善和實(shí)際應(yīng)用。以剛剛完成開(kāi)發(fā)工作的國(guó)際最先進(jìn)的陣列式多維液相色譜儀器為例，張祥民教授的團(tuán)隊(duì)利用該儀器在人血漿高豐度蛋白去除方面取得了新的技術(shù)突破。這項(xiàng)成果于近日已發(fā)表在《Analytical Chemistry》上。

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圖2. 陣列多維液相色譜儀器系統(tǒng)。下圖為陣列色譜系統(tǒng)照片，組件依次為第一維高效液相色譜泵，第二維高效液相色譜泵、陣列多維切換系統(tǒng)、陣列色譜柱組件，陣列餾分收集儀和系統(tǒng)自動(dòng)化控制系統(tǒng)。上部分左邊為陣列色譜捕集柱、分析柱及其連接流路，右邊為陣列餾分收集系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖。

　　對(duì)于人血漿樣品的蛋白組分析，一個(gè)重大挑戰(zhàn)是大量高豐度蛋白存在掩蓋了人們最感興趣的低豐度蛋白的信號(hào)。為此，必須使用免疫親和柱來(lái)處理血漿樣品，利用抗體來(lái)捕獲血漿中的高豐度蛋白，并將它們?nèi)コ簟５?，?shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，去除高豐度蛋白的同時(shí)大量附著的低豐度的蛋白也一同被除掉。而且，目前這類商品化親和柱最多只能去除20個(gè)高豐度蛋白質(zhì)。為了解決這些問(wèn)題，張祥民教授的團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)了這臺(tái)陣列式的多維色譜儀器，第一維采用陰離子交換色譜(SAX)，第二維采用8支反相液相色譜(RPLC)柱和8支蛋白捕集柱，開(kāi)展了多循環(huán)并行分離。血漿高豐度蛋白的去除時(shí)間，由以往的一個(gè)星期縮短到四個(gè)小時(shí)，鑒定蛋白的濃度范圍達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)，一次可去除84個(gè)高豐度蛋白。與免疫親和柱的方法相比較，獲得蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量有大幅提高。在實(shí)際樣品分析中，可鑒定出1332到1955個(gè)蛋白，包括一些豐度極低的膜體趨化因子、雄激素受體和肌苷脫氫酶等含量低至0.01 ng/mL的蛋白質(zhì)。已經(jīng)能夠滿足臨床常見(jiàn)的疾病標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)等標(biāo)志分子檢測(cè)需要。

　　陣列多維色譜儀市場(chǎng)還需培育，其應(yīng)用前景廣闊

　　在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，陣列多維色譜儀也遇到的不少問(wèn)題主要是市場(chǎng)的培育。由于陣列多維色譜技術(shù)比較新穎，因此前期需要市場(chǎng)培育和宣傳，投入資金較多。此外，陣列多維色譜不像傳統(tǒng)二維色譜可在線與質(zhì)譜儀連接，它需要和高通量質(zhì)譜聯(lián)用匹配。但是，隨著分析樣品越來(lái)越復(fù)雜，高通量的陣列多維色譜儀將迎來(lái)快速發(fā)展階段。張祥民談到，例如多維色譜技術(shù)，出現(xiàn)好多年一直沒(méi)有多少人去使用，近些年隨著生命科學(xué)發(fā)展，需要解決的問(wèn)題越來(lái)越復(fù)雜，特別是各種組學(xué)研究如蛋白組、代謝組等復(fù)雜體系的分離問(wèn)題解決不了，因此多維色譜技術(shù)被派上大用場(chǎng)。陣列多維色譜也是這樣，它的普及尚需要一個(gè)過(guò)程，但最后肯定會(huì)商品化，同時(shí)被廣大用戶所廣泛使用。

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????采訪編輯：郭曉東