2016年11月28日，基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。CRISPR/Cas9最初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌用來識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。

　　接下來，小編列舉最近一段時(shí)間CRISPR基因編輯系統(tǒng)取得的重大進(jìn)展，詳情如下所示。

　　1.Nature：利用MEMOIR方法讀取細(xì)胞的歷史

　　doi:10.1038/nature20777

　　在一項(xiàng)新的研究中，來自美國加州理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種新的方法來讀取細(xì)胞的歷史和“譜系圖”。 這種被稱作光學(xué)原位讀取人工突變存儲(chǔ)(Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In situ Readout, MEMOIR)的方法能夠記錄動(dòng)物細(xì)胞的生命歷史---它們與其他細(xì)胞之間的關(guān)系，溝通模式和影響它們的重大事件。相關(guān)研究結(jié)果于2016年11月21日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Synthetic recording and in situ readout of lineage information in single cells”。

　　兩種新的強(qiáng)大工具有助實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。在一種被稱作基因組編輯的工具中，在DNA切割系統(tǒng)CRISPR的幫助下，一種發(fā)育中的有機(jī)體的遺傳密碼能夠在任何指定的靶位點(diǎn)上發(fā)生改變。寫在一個(gè)細(xì)胞基因組中的任何改變可傳遞給它的后代。在動(dòng)物發(fā)育早些時(shí)候發(fā)生的改變將出現(xiàn)在它的很多細(xì)胞中，然而較為近期的改變將出現(xiàn)在更少的細(xì)胞中。通過分析發(fā)生的DNA編輯模式，研究人員能夠鑒定出這些細(xì)胞的共同祖先和計(jì)算出它們的親緣關(guān)系如何，比如，他們能夠確定哪些細(xì)胞是兄弟姐妹。類似的方法已被用于多種科學(xué)領(lǐng)域，包括中世紀(jì)史。

　　另一種工具，被稱作順序單分子熒光原位雜交(sequential single molecule Fluorescence In Situ Hybridization, seqFISH)，是由Cai開發(fā)的，用于了解哪些基因在單個(gè)細(xì)胞中是有活性的。在最近的一篇發(fā)表在Neuron期刊上的論文中，Cai團(tuán)隊(duì)展示了這種技術(shù)如何能夠被用來確定200多種基因在單個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)水平。這種方法也讓研究人員在細(xì)胞的體內(nèi)起源位置處分析它的基因活性。之前的技術(shù)需要這些細(xì)胞與它們的自然環(huán)境相分離。

　　在這項(xiàng)新的研究中，研究人員將這兩種工具結(jié)合在一起：seqFISH方法被用來追蹤通過CRISPR基因編輯引入到基因組中的變化。

　　這個(gè)系統(tǒng)不僅能夠被用來了解細(xì)胞譜系信息，而且也能夠被用來了解這些細(xì)胞過去發(fā)生的事件---它們何時(shí)接收來自彼此的信息或者它們何時(shí)從一種細(xì)胞類型變成另一種細(xì)胞類型。比如，當(dāng)腫瘤產(chǎn)生時(shí)，一些細(xì)胞可能接受來自其他細(xì)胞的不同分子信號(hào)，從而引發(fā)截然不同的命運(yùn)。一種細(xì)胞可能變成轉(zhuǎn)移性的和能夠遷移，而另一種細(xì)胞保持靜止不動(dòng)。追蹤過去的信號(hào)如何影響當(dāng)前的細(xì)胞命運(yùn)的能力可能為腫瘤的時(shí)空發(fā)育提供一種新的視角。

　　2. ACS Nano：繼全球首次人體臨床實(shí)驗(yàn)后，川大華西CRISPR研究再獲新進(jìn)展

　　doi:10.1021/acsnano.6b04261

　　近日，來自四川大學(xué)華西生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的魏于全院士課題組首次采用人工病毒進(jìn)行CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)輸送，成功在小鼠腫瘤模型中完成了靶基因編輯，達(dá)到了較好的腫瘤治療效果，相關(guān)成果發(fā)表在《美國化學(xué)學(xué)會(huì)·納米》雜志上。

　　。雖然目前為止已經(jīng)有不少研究用CRISPR進(jìn)行腫瘤基因編輯，但是這些研究存在著不少問題，使用的方法臨床轉(zhuǎn)化也相當(dāng)困難。目前研究采用的體內(nèi)給藥CRISPR-Cas9質(zhì)粒DNA的手段主要有三種，一種是水流動(dòng)力學(xué)注射，即將約為小鼠體重10%的DNA質(zhì)粒注射液通過尾靜脈在3-8秒內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)(腦補(bǔ)一下打點(diǎn)滴時(shí)的情形)，這會(huì)造成血壓瞬間升高，可能造成器官損傷，在人體內(nèi)幾乎無法實(shí)現(xiàn);另一種方式則是采用腺病毒載體進(jìn)行CRISPR質(zhì)粒DNA的輸送，但是腺病毒具有免疫原性，有引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，最重要的是由于CRISPR質(zhì)粒DNA太大，腺病毒負(fù)載能力實(shí)在太低，因此效率不高，心有余而力不足;第三種則是局部注射質(zhì)粒，其缺點(diǎn)不言而喻，對(duì)于人體深部疾病似乎鞭長莫及啊。

　　基于此，魏于全院士課題組合成了一種新型的人工病毒載體用于CRISPR-Cas9質(zhì)粒DNA的輸送，他們合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因(一個(gè)可以促使基因組穩(wěn)定、阻止細(xì)胞死亡的基因，乳腺癌病人腫瘤組織高表達(dá))的CRISPR-Cas9質(zhì)粒DNA(Cas9-hMTH1)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由于質(zhì)粒DNA帶負(fù)電，他們選擇了帶正電的氟原子修飾的聚乙烯亞胺(PF33)與質(zhì)粒DNA混合，通過正負(fù)電荷相互作用形成人工病毒(PF33/ Cas9-hMTH1，實(shí)際上就是一種納米顆粒)，同時(shí)為了增強(qiáng)人工病毒的輸送効率，他們采用一種多功能高分子RGD-R8-PEG-HA對(duì)人工病毒進(jìn)行修飾得到了靶向MTH1的多功能核殼結(jié)構(gòu)CRISPR-Cas9輸送人工病毒(RRPHC/Cas9-hMTH1)，這種高分子可以使人工病毒更穩(wěn)定，同時(shí)避免被免疫系統(tǒng)清除，RGD和HA可以同時(shí)靶向結(jié)合腫瘤部位高表達(dá)的整合素ανβ3和CD44受體，從而提高人工病毒在腫瘤部位的富集。同時(shí)，腫瘤部位高表達(dá)的透明酸質(zhì)(HA)酶可以降解HA，促進(jìn)Cas9-hMTH1在腫瘤中的釋放，從而增強(qiáng)療效。

　　體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明該人工病毒的轉(zhuǎn)染效率明顯高于商用轉(zhuǎn)染試劑SuperFect、Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000，表明該載體可以更有效攜帶Cas9-hMTH1進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)雙重靶向策略可以使該人工病毒更特異性結(jié)合并進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞完成基因敲除。功能性實(shí)驗(yàn)表明該人工病毒可以成功敲除MTH1，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。通過小鼠尾靜脈注射人工病毒(僅含5 微克 Cas9-hMTH1，而文獻(xiàn)報(bào)道水動(dòng)力學(xué)注射需要100 微克左右)后，可發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤組織有較多的人工病毒富集，免疫組化分析也顯示腫瘤部位MTH1蛋白表達(dá)量顯著降低，同時(shí)小鼠腫瘤生長及轉(zhuǎn)移也得到了明顯的抑制。最后他們對(duì)人工病毒的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)注射人工病毒對(duì)血細(xì)胞數(shù)量無明顯影響，基因測序顯示正常組織中的突變率均低于0.4%，且都不是插入或者缺失突變，僅為單堿基替換突變。

　　雖然他們認(rèn)為該人工病毒具有較好的安全性，可以用于腫瘤特定基因的敲除進(jìn)行腫瘤治療，但是筆者認(rèn)為0.4%的突變率是不是還是有點(diǎn)高呢，有沒有辦法再優(yōu)化一下繼續(xù)降低脫靶率呢?據(jù)報(bào)道，他們下一步的研究計(jì)劃是使用這種人工病毒輸送其他CRISPR-Cas9質(zhì)粒DNA及功能化的DNA結(jié)合蛋白用于拓展該人工病毒的應(yīng)用范圍。

　　3.利用CRISPR研究基因組“暗物質(zhì)”

　　超過98%的人類基因組由非編碼基因組成。這些非編碼基因被稱為基因組的“暗物質(zhì)”，它們能調(diào)控編碼基因的表達(dá)，從而影響人類健康和疾病進(jìn)程。自從人類基因組序列被公開發(fā)表以來，科學(xué)家們努力解析基因中的功能元件，包括非編碼調(diào)節(jié)區(qū)——參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的順式調(diào)節(jié)區(qū)和非編碼RNA(ncRNA)。轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)基因組中可能有數(shù)百至數(shù)千個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此研究起來非常復(fù)雜。目前常用的兩種研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)位點(diǎn)的方法是：1，耗時(shí)且復(fù)雜的增強(qiáng)子研究;2，在非天然狀態(tài)中克隆增強(qiáng)子或啟動(dòng)子序列，開展并行研究。最近Sanjana等人和Fulco等人的研究都指出，可以利用CRISPR技術(shù)在天然狀態(tài)里研究非編碼調(diào)控元件的功能。

　　大規(guī)模的生化試驗(yàn)使人們發(fā)現(xiàn)了由潛在的、被數(shù)百種蛋白靶向結(jié)合的調(diào)節(jié)序列。值得一提的是，識(shí)別脫氧核糖核酸酶I超敏感位點(diǎn)(deoxyribonuclease I hypersensitive site， DHS)和大規(guī)模染色質(zhì)免疫沉淀測序(chromatin immunoprecipitation–sequencing， ChIP seq)方法的提出，讓科學(xué)家們能夠全面地解析蛋白與染色質(zhì)結(jié)合的情況。然而，把這些分子和功能調(diào)控聯(lián)系起來非常困難。

　　由于使用不同的CRISPR載體可以無偏向性地敲除蛋白編碼基因，因此CRISPR篩選是研究非編碼基因功能的有力工具。與人類細(xì)胞中NGG(前間區(qū)序列鄰近基序)序列上游的基因序列同源的單引導(dǎo)RNA(single guide RNA， sgRNA)可以引導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)到達(dá)特定基因組位點(diǎn)，從而特異性地引起突變。首個(gè)CRISPR“敲除”篩選研究在基因組規(guī)模上誘導(dǎo)了全基因敲除，并克服了RNA干擾篩選中的諸多限制，例如脫靶效應(yīng)和敲除不完全(圖：CRISPR-Cas9篩選方法)。

　　Sanjana等人使用CRISPR工具來研究黑色素瘤細(xì)胞中調(diào)控vemurafenib(B-Raf蛋白V600E突變中，600位點(diǎn)的纈氨酸被谷氨酸所替代，而Vemurafenib抑制攜帶了V600E突變的B-Raf蛋白中的絲氨酸 – 蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域)抗性的序列。研究人員使用CRISPR工具靶向主要的抗性調(diào)節(jié)區(qū)域——NF1(neurofibromatosis type 1，神經(jīng)纖維瘤病1型基因)、NF2(neurofibromatosis type 2，神經(jīng)纖維瘤病2型基因)和CUL3(cullin 3，泛素連接酶3)。該方法中，向?qū)NA和反式激活crRNA(trans-activating crRNA)融合，引導(dǎo)來源于釀膿鏈球菌的Cas9(spCas9)在目標(biāo)位點(diǎn)處誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生突變。結(jié)果顯示，靶向CUL3的sgRNA在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)最為富集。sgRNA富集的區(qū)域，CUL3被敲除，這表明，CUL3似乎與染色體相互作用、組蛋白翻譯后修飾，以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)阻斷的調(diào)控區(qū)域相關(guān)。

　　Fulco等人利用CRISPR干擾系統(tǒng)，即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合，沉默靶向序列的表達(dá)。這種方法雖然實(shí)現(xiàn)了靶向性的基因沉默，但并未引起基因突變。研究者們?cè)O(shè)計(jì)的靶向序列圍繞在MYC和GATA1基因附近(這兩個(gè)基因能調(diào)控K562紅白血病細(xì)胞的增殖)。他們首先使用病毒感染細(xì)胞，將CRISPRi系統(tǒng)載帶進(jìn)入細(xì)胞，然后使用多西環(huán)素誘導(dǎo)dCas9靶向目標(biāo)序列。他們發(fā)現(xiàn)，sgRNA富集點(diǎn)恰好和包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的DHS重合。更有趣的是，dCas9靶向GATA1或組蛋白脫乙酰酶6(HDAC6)增強(qiáng)子時(shí)，都會(huì)減少HDAC6表達(dá)。這表明，對(duì)于共同的增強(qiáng)子(GATA1和HDAC6存在共同的增強(qiáng)子)，基因之間存在競爭關(guān)系。鑒定出來的MYC增強(qiáng)子的位置與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CCCTC-結(jié)合因子(CTCF，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用)結(jié)合位點(diǎn)都是吻合的。這可能是MYC調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制。

　　4.基因編輯器CRISPR讓突變小鼠觸手可得

　　如今，絕大多數(shù)小鼠培育者都知道CRISPR。長久以來，JAX和其他培育新的小鼠品系的實(shí)驗(yàn)室依賴于一個(gè)辛苦費(fèi)力的多步驟過程，其中涉及利用基因工程技術(shù)改變小鼠的胚胎干細(xì)胞，將其注射進(jìn)胚胎，并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團(tuán)隊(duì)，也需要用2年時(shí)間才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一種可在受精卵上開展針對(duì)性基因手術(shù)的分子復(fù)合物替代了所有這一切。它能在6個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生一種被改造的小鼠。

　　Jaenisch首次證明了CRISPR在產(chǎn)生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人員首次證實(shí)CRISPR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中奏效的5個(gè)月后，Jaenisch和同事于2013年5月在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表了一篇論文。他們報(bào)告稱，該技術(shù)成功斷開了一組小鼠胚胎干細(xì)胞中的5個(gè)基因，而這在以前是不可能的。更重要的是，他們證實(shí)可完全繞過胚胎干細(xì)胞，并且同時(shí)敲除單細(xì)胞小鼠受精卵中的兩個(gè)基因。研究人員不再需要改造胚胎干細(xì)胞并不辭辛苦地培育若干代小鼠，以產(chǎn)生卵子或精子細(xì)胞中攜帶基因突變的小鼠。同時(shí)，研究人員若想培育擁有兩個(gè)突變的小鼠，也不再需要將單突變體雜交并經(jīng)歷一個(gè)類似的耗時(shí)且煩瑣的流程，以獲得擁有被改變生殖細(xì)胞系的小鼠后代。

　　自此以后，已有500余篇論文詳細(xì)描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因?！八a(chǎn)生的影響是巨大的?！痹?974年培育出首個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多倫多大學(xué)生物化學(xué)家Tak Mak則認(rèn)為，此項(xiàng)技術(shù)真正改變了獲得這些被改造動(dòng)物的時(shí)間和效率。據(jù)Mak估測，和利用胚胎干細(xì)胞相比，利用CRISPR改造小鼠的花費(fèi)要便宜30%左右，從而使他的平均成本大大降低。

　　CRISPR的影響不能僅通過節(jié)省成本來衡量。此項(xiàng)技術(shù)的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能，從而解決了來自多倫多病童醫(yī)院的C. C. Hui最近面臨的特定問題：在基因敲除過程中，缺失基因未產(chǎn)生任何可觀察到的效應(yīng)。Hui意識(shí)到，被敲除的基因同另一個(gè)可能對(duì)其作出補(bǔ)償?shù)幕虼嬖陉P(guān)聯(lián)。他向在多倫多表型基因組學(xué)中心監(jiān)管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來自初始基因敲除過程的受精卵中的干擾基因發(fā)生突變。“我們獲得了受精卵，將CRISPR-Cas9注射進(jìn)去。8周后，Hui便獲得了雙突變體?！盢utter介紹說，“如果利用胚胎干細(xì)胞，可能需要好幾年才能完成。”

　　5.Nature：中國首次利用CRISPR–Cas9編輯過的細(xì)胞開展人體臨床試驗(yàn)

　　doi:10.1038/nature.2016.20988

　　來自中國成都市四川大學(xué)華西醫(yī)院的一個(gè)研究人員團(tuán)隊(duì)首次將利用CRISPR–Cas9進(jìn)行過基因編輯的細(xì)胞注射到一名病人體內(nèi)?！蹲匀弧菲诳瘓?bào)道這一注射過程是在2016年10月28日發(fā)生的，而且迄今為止，這名病人表現(xiàn)得 “還不錯(cuò)”。

　　經(jīng)過基因修飾的細(xì)胞之前已被注射到人體內(nèi)，但是是利用不同的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。CRISPR-Cas9被認(rèn)為是一種更加高效的方法。在這項(xiàng)新的努力中，該團(tuán)隊(duì)從血液樣品中分離出免疫細(xì)胞，然后利用CRISPR-Cas9尋找它們中的PD-1蛋白，并且讓該蛋白不能發(fā)揮功能，而之前的研究已證實(shí)這會(huì)延緩免疫細(xì)胞作出的免疫反應(yīng)。人們的看法是讓這種蛋白失去功能將允許免疫系統(tǒng)更強(qiáng)地抵抗腫瘤生長。這些利用CRISPR-Cas9進(jìn)行過基因編輯的細(xì)胞被放置在一個(gè)容器中，在那里，它們?cè)隗w外培養(yǎng)后能夠發(fā)生增殖---它們隨后經(jīng)收集后被注射到一名肺癌病人體內(nèi)，其中這名病人已不能夠?qū)θ魏纹渌寞煼ㄗ鞒龇磻?yīng)。

　　這種CRISPR-Cas9技術(shù)涉及利用一種結(jié)合特定DNA序列的向?qū)NA和一種能夠在事先選擇的位點(diǎn)上切割DNA鏈的Cas9酶，從而允許移除DNA鏈，或者加入新的DNA片段。

　　這項(xiàng)研究是由四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤學(xué)家盧鈾教授領(lǐng)導(dǎo)的。它涉及一名已接受注射的病人和9名其他的志愿者。

　　盧鈾團(tuán)隊(duì)披露出，這名病人已被安排第二次接受利用CRISPR–Cas9進(jìn)行過基因編輯的免疫細(xì)胞注射，但是未給出具體的時(shí)間。這名病人和這項(xiàng)臨床試驗(yàn)的9名其他的志愿者將被密切監(jiān)控6個(gè)月的時(shí)間來確定這些接受過基因編輯的細(xì)胞是否會(huì)導(dǎo)致任何不良影響---直到那時(shí)盧鈾團(tuán)隊(duì)才會(huì)著重關(guān)注這些細(xì)胞是否確實(shí)在延緩或逆轉(zhuǎn)癌癥生長中發(fā)生影響。

　　6.Nature：重磅!首次利用CRISPR-Cas9對(duì)非分裂細(xì)胞進(jìn)行基因編輯

　　doi:10.1038/nature20565

　　在一項(xiàng)新的研究中，來自美國沙克研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)基因編輯的圣杯---首次能夠在基因組的靶位點(diǎn)上將DNA插入到非分裂細(xì)胞(non-dividing cell)中，其中非分裂細(xì)胞占成年器官和組織中的大多數(shù)。他們證實(shí)這種技術(shù)能夠部分恢復(fù)失明的嚙齒類動(dòng)物的視覺反應(yīng)。它將為基礎(chǔ)研究和多種治療視網(wǎng)膜疾病、心臟疾病和神經(jīng)疾病等疾病的方法打開新的途徑。相關(guān)研究結(jié)果于2016年11月16日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration”。

　　在此之前，修飾DNA的技術(shù)---如CRISPR-Cas9系統(tǒng)---已最為有效地利用分裂細(xì)胞(dividing cell)的正常復(fù)制機(jī)制在這些細(xì)胞(如在皮膚或腸道中的那些細(xì)胞)當(dāng)中在發(fā)揮作用。沙克研究所開發(fā)的這種新技術(shù)在將新的DNA整合到體外培養(yǎng)的分裂細(xì)胞中的效率比其他方法高10倍，使得它成為一種大有希望的用于研究和藥物開發(fā)的工具。但是，更為重要的是，這種新技術(shù)首次代表著科學(xué)家們成功地將一種新的基因插入到不再發(fā)生分裂的成體細(xì)胞(如在眼睛、大腦、胰腺或心臟中的那些細(xì)胞)中準(zhǔn)確的DNA位點(diǎn)上，從而為在這些細(xì)胞中進(jìn)行治療應(yīng)用提供新的可能。

　　為了做到這一點(diǎn)，研究人員瞄準(zhǔn)一種被稱作非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)的DNA修復(fù)細(xì)胞通路，其中NHEJ通過將發(fā)生常規(guī)斷裂的DNA鏈末端重新連接在一起對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。他們將這個(gè)過程與現(xiàn)存的基因編輯技術(shù)組合使用，從而成功地將新的DNA插入到非分裂細(xì)胞中的精確位點(diǎn)上。

　　7.Nature子刊：北大魏文勝、哈佛劉小樂課題組完成首次CRISPR lncRNA基因高通量功能篩選

　　doi:10.1038/nbt.3715

　　CRISPR–Cas系統(tǒng)是近年來興起的一種高效的基因編輯技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用范圍，其中就包括功能基因篩選。人們可以建立一個(gè)單鏈向?qū)NA(sgRNA)的庫，用其中的sgRNA去靶向作用于多種基因的編碼區(qū)域，然后再以所研究功能相關(guān)的目標(biāo)表型對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，從而找到與該功能相關(guān)的基因。

　　這一策略利用了細(xì)胞中傾向于產(chǎn)生差錯(cuò)DNA修復(fù)途徑——非同源性末端接合(NHEJ)，通過CRISPR–Cas系統(tǒng)在目標(biāo)基因片段中制造DNA雙鏈斷裂，是細(xì)胞采用NHEJ進(jìn)行修復(fù)，最終在原斷裂位點(diǎn)留下插入/缺失突變。對(duì)于編碼蛋白的基因，少數(shù)堿基對(duì)的加入或去除便可能帶來移碼突變、錯(cuò)義突變等嚴(yán)重影響蛋白正常功能的因素，最終反映在表型上。

　　然而，對(duì)于轉(zhuǎn)錄非編碼RNA的基因來說，上述策略則難以用于功能篩選，因?yàn)閮H有插入/缺失突變很可能并不能顯著影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表型。為此，人們需要制造影響更大的突變，比如基因中大片段的缺失，以造成可觀察到的表型改變，而這樣的突變可以通過配對(duì)向?qū)NA(pgRNA)來實(shí)現(xiàn)。CRISPR–Cas系統(tǒng)在兩種分別靶向目標(biāo)基因不同位點(diǎn)的gRNA的指導(dǎo)下，在同一基因中造成兩處DNA雙鏈斷裂。在細(xì)胞對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)的過程中，上述兩個(gè)斷裂點(diǎn)之間的基因片段可能會(huì)被“遺漏”，最終不會(huì)出現(xiàn)在修復(fù)完畢的基因中。

　　最近，北京大學(xué)魏文勝教授和哈佛大學(xué)劉小樂教授的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)基于上述策略，以慢病毒為載體構(gòu)建出pgRNA庫，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)人源肝癌細(xì)胞系Huh7.5OC中的近700個(gè)癌癥或其他疾病相關(guān)長鏈非編碼RNA(lncRNA)的基因進(jìn)行了功能篩選。這一成果發(fā)表于近期的Nature子刊《Nature Biotechnology》上。

　　研究者以細(xì)胞增殖為表型，采用MAGeCK算法對(duì)lncRNA基因敲除影響的顯著性進(jìn)行了分析，最終篩選出了43種和8種在敲除后分別抑制(即負(fù)向選擇)和促進(jìn)(即正向選擇)細(xì)胞增殖的lncRNA基因。在接下來的驗(yàn)證性分析中，研究者選取了5種負(fù)向選擇和4種正向選擇lncRNA，在Huh7.5OC細(xì)胞中對(duì)其進(jìn)行了敲除、回補(bǔ)、轉(zhuǎn)錄激活或抑制處理，結(jié)果均符合其對(duì)細(xì)胞增殖或存活等方面的影響。在上述9個(gè)lncRNA中，正向選擇的LINC01087還被進(jìn)行了進(jìn)一步的功能分析。結(jié)果顯示，LINC01087的敲除導(dǎo)致一系列肝癌相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，如FOS和FOSB等。

　　8.Nature：利用CRISPR/Cas9治療鐮狀細(xì)胞疾病取得重大進(jìn)展

　　doi:10.1038/nature20134

　　在一項(xiàng)新的研究中，來自美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員利用一種被稱作CRISPR/Cas9的基因編輯工具修復(fù)人干細(xì)胞中導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞疾病的基因。這是開發(fā)一種治療這種疾病的基因療法的關(guān)鍵一步。相關(guān)研究結(jié)果于2016年11月7日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR/Cas9 Beta-globin Gene Targeting in Human Hematopoietic Stem Cells”。論文第一作者是博士后研究員Daniel Dever博士和Rasmus Bak博士，論文通信作者是Matthew Porteus博士。

　　研究人員繼續(xù)證實(shí)這些被修復(fù)的干細(xì)胞能夠制造功能性的血紅蛋白分子---在正常的紅細(xì)胞中，這些分子攜帶氧氣---并且成功地將這些干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)。他們說這項(xiàng)研究代表著一種修復(fù)鐮狀細(xì)胞疾病和地中海貧血等血源性遺傳疾病的概念驗(yàn)證。

　　Porteus說，在之前的研究中，他已利用較為老舊的基因編輯技術(shù)靶向鐮形細(xì)胞基因，但是利用這種新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)開展研究更為快速和更加簡單。他注意到，“我們花了6年時(shí)間試圖利用這種舊的基因編輯技術(shù)靶向β-珠蛋白基因”，并且補(bǔ)充道，利用CRISPR/Cas9技術(shù)僅需一周時(shí)間，他們就擁有一種發(fā)揮更好作用的基因編輯工具。

　　CRISPR/Cas9基因編輯工具是一種切割靶DNA序列的Cas9酶和一種將這種酶精確地帶到你想要進(jìn)行切割的位點(diǎn)---在這項(xiàng)研究中，指的是鐮形細(xì)胞突變位點(diǎn)---的向?qū)NA(gRNA)。一旦這些發(fā)生突變的DNA序列被移除，其他的工具能夠協(xié)助接入一種正常的DNA序列拷貝。

　　Porteus團(tuán)隊(duì)利用從鐮形細(xì)胞疾病患者的血液中獲得的造血干細(xì)胞開展研究，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)校正這種基因突變，隨后對(duì)這些造血干細(xì)胞進(jìn)行濃縮以便它們中的90%攜帶獲得校正的鐮形細(xì)胞基因。該團(tuán)隊(duì)將這些濃縮后的獲得校正的造血干細(xì)胞注射到年輕的小鼠體內(nèi)。

　　當(dāng)16周后，Porteus團(tuán)隊(duì)研究這些小鼠的骨髓時(shí)，這些得到校正的造血干細(xì)胞在那里茁壯成長，并且開始制造其他的血細(xì)胞。

　　Porteus說，這些獲得校正的紅細(xì)胞不需要替換病人體內(nèi)所有的鐮形細(xì)胞。如果鐮形細(xì)胞的比例低于30%，那么病人不會(huì)產(chǎn)生疾病癥狀。他說，獲得校正的細(xì)胞具有的優(yōu)勢(shì)大約是未得到校正的細(xì)胞的10倍。這是因?yàn)槭艿界犘渭?xì)胞影響的紅細(xì)胞傾向于呈鐮形，而且平均僅10天后就會(huì)死掉。相比之下，獲得校正的細(xì)胞具有正常紅細(xì)胞的壽命：大約120天。因此，這些獲得校正的細(xì)胞的數(shù)量快速地超過未獲得校正的細(xì)胞的數(shù)量。

　　9.PNAS：在小鼠細(xì)胞中利用CRISPR-Cas9技術(shù)高效進(jìn)行基因組編輯

　　doi:10.1073/pnas.1613884113

　　為了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)切割基因，人們必需設(shè)計(jì)一種與靶基因的DNA相匹配的RNA序列。大多數(shù)基因具有上百個(gè)這樣的在基因組中的活性和獨(dú)特性上存在差異的序列。因此，尋找最佳的序列很難通過手工實(shí)現(xiàn)。一種新的“CrispRGold”程序有助科學(xué)家們鑒定出最為高效的和最為特異性的RNA序列。這種程序是由德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心科學(xué)家Klaus Rajewsky教授領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的。該團(tuán)隊(duì)也開發(fā)出一種新的已攜帶Cas9蛋白的模式小鼠。將這種模式小鼠和這些可靠的RNA序列結(jié)合在一起導(dǎo)致原代細(xì)胞中的基因高效地失活。這就使得研究人員能夠發(fā)現(xiàn)參與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的新基因。

　　這僅需一種將Cas9酶帶到將被切割的DNA位點(diǎn)上的RNA片段。這種RNA片段被稱作單向?qū)NA(sgRNA)，含有長20個(gè)堿基(A、U、C或G)的與基因組靶位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。在此之前，科學(xué)家們不得不通過手工費(fèi)力地選擇或者利用多種在線工具選擇sgRNA。在某些情形下，人們并不確定所選的sgRNA是否將Cas9酶攜帶到基因組上合適的位點(diǎn)或者一種類似的但不是所想要的位點(diǎn)，以及這種sgRNA的效率是否比較高。

　　這種新的“CrispRGold”程序使得讓特定基因失去功能變得更加簡單。它尋找確定的DNA靶序列以便鑒定出進(jìn)行切割的最佳位點(diǎn)并且提示一種在遺傳物質(zhì)上獨(dú)特的僅運(yùn)送Cas9蛋白到所需位點(diǎn)上的sgRNA序列然后能夠切割靶基因以至于它不能夠發(fā)揮功能。這種程序是基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和這些序列的獨(dú)特性和其他性質(zhì)而被開發(fā)出來的。

　　通過與Van Trung Chu博士合作，來自Rajewsky教授領(lǐng)導(dǎo)的這個(gè)團(tuán)隊(duì)的博士生Robin Graf在小鼠的B細(xì)胞中測試了這個(gè)系統(tǒng)。這些細(xì)胞不能夠在體外培養(yǎng)非常長的時(shí)間，這是因?yàn)樗鼈儾粫?huì)它們的自然環(huán)境外存活較長的時(shí)間。因此，基因在很多B細(xì)胞中必需盡可能快地失活以便研究它們的功能。Chu通過培養(yǎng)一種產(chǎn)生大量的但是具有良好數(shù)量耐受性的Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠品系而實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

　　研究人員隨后從這些小鼠體內(nèi)分離出B細(xì)胞，將單個(gè)基因特異性的sgRNA運(yùn)送到這些細(xì)胞中。Graf說，利用CrispRGold程序設(shè)計(jì)出的sgRNA在平均80%的這些細(xì)胞中高重復(fù)率地破壞這些靶基因?！霸谶@種類型的低通量實(shí)驗(yàn)中，高效率和低錯(cuò)誤率是絕對(duì)必要的?！?/div>