何為非變性質(zhì)譜?就是選用溫和的溶液體系及質(zhì)譜條件，使蛋白保持在非變性狀態(tài)下被分析。聽到這，有些小伙伴可能會一頭霧水：師兄師姐教我處理蛋白質(zhì)樣品的時候，第一步就是要變性啊，怎么現(xiàn)在又不要變性了?

　　在通常的蛋白質(zhì)相關(guān)分析中，為了破壞蛋白質(zhì)的三維立體空間結(jié)構(gòu)，便于酶解等操作，會通過加熱或是加入高濃度的變性試劑(如尿素、鹽酸胍等)，使蛋白質(zhì)變性;另外，對于常用的分離手段——反相色譜來講，其流動相的酸性pH條件與高有機(jī)相同樣也會使蛋白質(zhì)變性。當(dāng)需要對蛋白質(zhì)中的非共價結(jié)合進(jìn)行研究時，為了避免非共價結(jié)合被強(qiáng)烈的變性條件所破壞，則需在非變性的液相-色譜條件下(通常為50mM醋酸銨，pH=7的中性體系)進(jìn)行研究;另外，對于組成較為復(fù)雜的蛋白樣品，在非變性條件下分析時，由于體系中質(zhì)子數(shù)減少，所以蛋白電荷態(tài)數(shù)目也會相應(yīng)減少，電荷態(tài)之間的相互重疊度也會下降，進(jìn)而減少復(fù)雜組分之間的相互影響，從而能夠得到復(fù)雜蛋白樣品中每個組分的分子量信息(圖1)。

　圖1 同一樣品分別于變性及非變性條件下進(jìn)行分子量測定的原始譜圖

　　目前，非變性質(zhì)譜技術(shù)主要應(yīng)用在兩個方面：一是生物制藥領(lǐng)域，通過打開單克隆抗體鏈間二硫鍵后在Cys位點(diǎn)上偶聯(lián)小分子藥物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此類藥物的鏈間僅靠非共價力結(jié)合，故變性條件下各條鏈會分離，無法測得其完整狀態(tài)的分子量;另一應(yīng)用方向為研究蛋白質(zhì)多聚體，非變性條件下不僅可以保持各個亞基間的非共價相互作用，同時由于中性條件更接近生理狀態(tài)，得到的結(jié)果更具意義。

　　現(xiàn)在，非變性質(zhì)譜與氫氘交換、X-ray衍射、核磁共振、冷凍電鏡和cross-linking等技術(shù)聯(lián)合使用、互為補(bǔ)充，已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用在結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究中。本期文章將會重點(diǎn)介紹非變性質(zhì)譜在治療性生物醫(yī)藥制品完整分子量測定中的研究，下期文章將會側(cè)重介紹非變性質(zhì)譜用于蛋白復(fù)合物的研究進(jìn)展。

Orbitrap超高分辨質(zhì)譜：非變性質(zhì)譜研究的理想平臺

　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!針對于非變性質(zhì)譜研究中的需求，我們在Orbitrap質(zhì)譜平臺上對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括離子源區(qū)脫溶劑能量、質(zhì)量范圍的擴(kuò)展以及高質(zhì)荷比離子傳輸效率的優(yōu)化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高質(zhì)量精度及高靈敏度基礎(chǔ)上，在非變性質(zhì)譜領(lǐng)域也能有出色表現(xiàn)。

　　圖2 Orbitrap質(zhì)譜平臺用于非變性質(zhì)譜分析

　　上文中提到，在生物制藥領(lǐng)域中，會通過分子工程設(shè)計，在單克隆抗體的特定氨基酸上通過化學(xué)反應(yīng)，偶聯(lián)上小分子治療藥物，通過單克隆抗體的靶向識別功能將小分子藥物精確帶至病變細(xì)胞處并釋放，達(dá)到精確給藥、減少毒副作用的目的，這類藥物被稱作抗體藥物偶聯(lián)物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在這類藥物中，通過將單抗鏈間二硫鍵打開從而在Cys位點(diǎn)上偶聯(lián)藥物的Cys-ADC，由于其鏈間僅靠非共價力結(jié)合，故需在非變性質(zhì)譜條件下才能對其完整分子量進(jìn)行測定(圖3)。

　　圖3 Cys-ADC結(jié)構(gòu)示意圖

　　圖4展示了使用非變性質(zhì)譜平臺對Cys-ADC進(jìn)行完整分子量測量的結(jié)果。由圖中不難發(fā)現(xiàn)，使用體積排阻色譜(SEC)，可以將單克隆抗體與其他雜質(zhì)分離開，而Orbitrap質(zhì)譜平臺能夠得到基線分離、信噪比高的原始譜圖。經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件解卷積處理后，可見偶聯(lián)了0/2/4/6/8個小分子藥物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征;解卷積后計算所得該ADC的藥物/抗體比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，與之前報道過的DAR值相符。

　　圖4 使用非變性質(zhì)譜平臺對Cys-ADC進(jìn)行完整分子量測量。

　　(上)，原始色譜/質(zhì)譜圖;(下)，解卷積后譜圖。

　　作為對照，在變性條件下也對同一個樣品進(jìn)行了分子量測定(圖5)，發(fā)現(xiàn)鏈間的非共價結(jié)合在強(qiáng)烈的變性條件下均被破壞，只能觀察到部分ADC的分子量信息。該實驗進(jìn)一步說明了在非變性條件下對Cys-ADC進(jìn)行分子量測定的必要性。

　　圖5 變性質(zhì)譜條件下對Cys-ADC進(jìn)行分子量測量。

　　(上)，原始色譜/質(zhì)譜圖;(下)，解卷積后譜圖。

　　對于常見的另外一種ADC——Lys-linked ADC，雖然其小分子藥物與單克隆抗體是通過共價鍵相結(jié)合，但偶聯(lián)上小分子藥物后，ADC的復(fù)雜度大大增加，此時若在非變性條件下進(jìn)行分子量測定，可以減少信號之間的干擾，得到更加準(zhǔn)確的測量結(jié)果(圖6)。

　　▲非變性條件可減少復(fù)雜組分間信號重疊

　　▲非變性條件下Lys-ADC完整分子量測量結(jié)果

　　圖6 使用非變性質(zhì)譜平臺對Lys-ADC進(jìn)行完整分子量測量。

　　小結(jié)

　　本期我們對非變性質(zhì)譜技術(shù)的原理、適用范圍進(jìn)行了介紹，并以Cys-ADC與Lys-ADC樣品的完整分子量測量為例展示了該方法的應(yīng)用，不知道小伙伴們有沒有對非變性質(zhì)譜技術(shù)有個初步的了解呢?下期我們將會介紹該技術(shù)在蛋白復(fù)合物研究中的應(yīng)用，各位看官走過路過不要錯過，我們下期見!

　　參考文獻(xiàn)

　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4;86 (21):10674-83.

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