原生質(zhì)體電子顯微鏡觀察鑒別實驗技術的應用

在溶壁酶的作用下，將真菌的細胞壁溶解，不同的真菌、同一種真
菌不同的菌態(tài)以及同一菌絲體不同部位的細胞的細胞壁的成分、厚
度皆不相同。相對薄弱的部位最先解體，形成孔洞，釋放原生質(zhì)體
。當溶壁酶開始對細胞壁發(fā)生作用時，細胞膜上的釋別信號就對這
一外部作用作出了精確的反應，質(zhì)膜收縮，發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，并
形成具有再生能力的原生質(zhì)體。其目的就是分離到數(shù)量多、生活能
力強的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體分離技術包括最佳分離條件的選擇、鑒
別方法、保藏方法等。

  隨真菌種類的不同，最佳分離條件的選擇也不同，大體上包括
如下技術：預處理，培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)方法，菌態(tài)和菌齡，
溶壁酶的種類、濃度和配比，酶解方法，酶解溫度，酶解時間，滲
透壓穩(wěn)定劑的種類、濃度等。
  鑒別方法和技術包括：原生質(zhì)體計數(shù)方法、活力鑒別技術，細
胞核染色技術，原生質(zhì)體電子顯微鏡觀察技術，細胞培養(yǎng)小室應用
技術，DNA分離與純化技術，染色體DNA測定技術，熒光素標記技術
等。 
  保藏方法和技術包括：超低溫保藏技術和低溫藏油法保藏技術
。
  原生質(zhì)體融合的原理和技術
  真菌的原生質(zhì)體融合是指雙親原生質(zhì)體，在化學助融合劑、電
脈沖和激光束等誘導下相互融合。根據(jù)親本性質(zhì)的不同，將原生質(zhì)
體融合分為原生質(zhì)體與原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體與細胞核和染色體
的融合以及原生質(zhì)體對細胞器的攝取。根據(jù)誘導原生質(zhì)雜交因子的
性質(zhì)不同，將原生質(zhì)體融合分為化學融合、物理融合和生物融合三
大類。根據(jù)融合親本親緣關系遠近，將真菌原生質(zhì)體融合分為近緣
原生質(zhì)體融合和遠緣原生質(zhì)體融合兩大類。當前真菌細胞工程學中
應用最廣的原生質(zhì)體融合技術為聚乙二醇(PEG)誘導的化學融合和
電脈沖誘導的電融合。

  融合的機制：膜融合是一種非常重要的生物學現(xiàn)象，也是生物
界普遍存在的一種現(xiàn)象如受精、胞飲、吞噬、菌絲融合等。這一細
胞及亞細胞水平事件涉及細胞的內(nèi)吞、外排及與外界交換物質(zhì)、能
量等。膜的融合是原生質(zhì)融合非常關鍵的一個步驟。隨著各種誘導
因子的發(fā)現(xiàn)，各種膜誘導模型也隨之建立，“局部脫水與膜融合”
模型更多地被人們所接受。也有人提出原生質(zhì)體融合是由于膜表面
電荷誘導融合的模式。PEG誘導的原生質(zhì)體融合機制有：原生質(zhì)體
局部脫水，改變了質(zhì)膜內(nèi)外的電位差，以分子橋形式溝通兩原生質(zhì)
膜和改變膜的流動性，質(zhì)膜蛋白質(zhì)顆粒凝聚等。電脈沖誘導的原生
質(zhì)體融合機制有電介質(zhì)電泳、穩(wěn)定的膜接觸、可逆電擊穿、串珠形
成等。無論是PEG誘導的融合，或者電泳沖誘導的融合，脫去細胞
膜表面的結合水都是必需的步驟。由于原生質(zhì)體先發(fā)生了膜融合的
關鍵步驟，細胞質(zhì)和細胞核融合才有可能進行。原生質(zhì)體融合過程
不僅僅是一個復雜的物理化學過程，而且也是一個復雜的生命活動
過程。對于融合的機制，還有許多問題不清楚，尚待深人研究。

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