獸用疫苗很重要

　　我國(guó)是全球最大的家禽、家畜生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。獸用疫苗在家禽、家畜疾病的預(yù)防和控制中發(fā)揮了重要作用，為畜牧業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展提供了重要保障。我國(guó)的獸用疫苗從無到有，從粗放式到規(guī)范化快速發(fā)展，已發(fā)展成為一個(gè)品種多、覆蓋面廣的高增長(zhǎng)行業(yè)。2015年的市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)120多億元，近7年年均復(fù)合增長(zhǎng)率超過17%，在未來的5-10年里仍將保持13-15%的高速增長(zhǎng)。

　　為保證疫苗的安全性和有效性，降低接種疫苗的副作用和雜質(zhì)的免疫干擾，需要對(duì)疫苗進(jìn)行有效的分離純化，去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的其它雜質(zhì)，提高疫苗有效成分的含量和純度。

　　由于獸用疫苗對(duì)生產(chǎn)成本控制要求極高，以及早期人們對(duì)獸用疫苗純化技術(shù)與工藝缺乏系統(tǒng)的研究，傳統(tǒng)的純化技術(shù)大多采用微濾、超濾、沉淀(PEG沉淀、硫酸銨沉淀等)、超速離心等初級(jí)的純化方法，雜質(zhì)去除效果有限，導(dǎo)致疫苗純度低、安全性差、副作用大。

　　隨著市場(chǎng)對(duì)高端疫苗需求的日益擴(kuò)大，疫苗研發(fā)機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)廠家對(duì)提高疫苗質(zhì)量的重視和投入，以往人用疫苗純化所采用的各種層析技術(shù)及分析檢測(cè)技術(shù)逐漸開始應(yīng)用于獸用疫苗的分離純化和分析檢測(cè)中來。與人用疫苗相比，獸用疫苗對(duì)生產(chǎn)成本極其敏感，對(duì)純度要求相對(duì)較低，如何簡(jiǎn)化純化工藝、提高純化效率、降低純化成本，對(duì)于獸用疫苗的產(chǎn)業(yè)化尤其重要。

　　需要什么樣的獸用疫苗

　　為保證疫苗的安全性和有效性，降低接種疫苗的副作用和雜質(zhì)的免疫干擾，需要對(duì)疫苗進(jìn)行有效的分離純化，去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的其它雜質(zhì)，提高疫苗有效成分的含量和純度。

　　由于獸用疫苗對(duì)生產(chǎn)成本控制要求極高，以及早期人們對(duì)獸用疫苗純化技術(shù)與工藝缺乏系統(tǒng)的研究，傳統(tǒng)的純化技術(shù)大多采用微濾、超濾、沉淀(PEG沉淀、硫酸銨沉淀等)、超速離心等初級(jí)的純化方法，雜質(zhì)去除效果有限，導(dǎo)致疫苗純度低、安全性差、副作用大。

　　隨著市場(chǎng)對(duì)高端疫苗需求的日益擴(kuò)大，疫苗研發(fā)機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)廠家對(duì)提高疫苗質(zhì)量的重視和投入，以往人用疫苗純化所采用的各種層析技術(shù)及分析檢測(cè)技術(shù)逐漸開始應(yīng)用于獸用疫苗的分離純化和分析檢測(cè)中來。與人用疫苗相比，獸用疫苗對(duì)生產(chǎn)成本極其敏感，對(duì)純度要求相對(duì)較低，如何簡(jiǎn)化純化工藝、提高純化效率、降低純化成本，對(duì)于獸用疫苗的產(chǎn)業(yè)化尤其重要。

　　傳統(tǒng)疫苗純化技術(shù)

　　沉淀法

　　沉淀法，即通過向蛋白質(zhì)溶液中加入鹽、有機(jī)溶劑、聚合物，改變?nèi)芤旱膒H或溫度，從而使蛋白質(zhì)沉淀出來的方法。最常用的沉淀劑主要有硫酸銨、硫酸鈉、乙醇、丙酮、PEG等。例如在口蹄疫病毒的純化中，所采用的沉淀方法主要包括硫酸銨沉淀法、PEG沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、魚精蛋白沉淀法等。沉淀法對(duì)疫苗的純化效果有限，單步處理所得到的疫苗純度質(zhì)量較低，往往作為樣品預(yù)處理的一種有效方法。

　　超濾法

　　超濾法是利用超濾膜在一定的驅(qū)動(dòng)力下使水、無機(jī)鹽等小分子通過，截留一定大小的大分子或病毒等顆粒，進(jìn)而使大顆粒得到濃縮的方法。超濾法已成為蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換的首選方法。超濾膜的材料一般選用聚砜、聚醚砜等多聚物;而在疫苗等生物大分子領(lǐng)域，應(yīng)用最多的是再生纖維素。超濾法是從大量病毒原料液中濃縮病毒樣品的一種非常快捷高效的方法，其優(yōu)點(diǎn)是操作條件簡(jiǎn)單、處理量大、疫苗損失小;在進(jìn)行濃縮的同時(shí)還可以根據(jù)分子大小的差異(類似凝膠過濾層析)起到一定的純化效果，但超濾法的選擇性不高，只能透過或截留一定分子量的物質(zhì)，使得最終得到的濃縮液中還會(huì)含有大量的大分子雜質(zhì)，分辨率低于凝膠過濾層析。在超濾過程中，選擇合適的膜組件以及優(yōu)化合適的操作條件，對(duì)疫苗回收率的影響非常大。此外，疫苗等分子在膜上的吸附和超濾過程中的濃差極化現(xiàn)象，對(duì)超濾的應(yīng)用效果也有顯著的負(fù)面影響。

　　王振輝等[1]采用超濾方法對(duì)效力檢驗(yàn)不合格的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒滅活液進(jìn)行濃縮和純化處理(0.6/0.8/1.0微米的微濾膜過濾碎片等雜質(zhì)、陶瓷膜過濾器(10k)濃縮和純化、0.22微米濾膜無菌過濾)。結(jié)果表明，雜蛋白去除率達(dá)到62-70%;免疫至63 d時(shí)中和抗體效價(jià)(ELISA)平均高達(dá)245.7 稀釋倍數(shù)，比常規(guī)疫苗中和抗體效價(jià)平均高出66.3 稀釋倍數(shù)。

　　超速離心法

　　超速離心技術(shù)主要包括差速離心和密度梯度離心2種類型，可用于樣品濃縮、樣品分析和生物大分子(病毒顆粒等)的分離純化。差速離心法常用于對(duì)純度和產(chǎn)量要求不高時(shí)的分離，通過不同的離心速度使顆粒從溶液中沉淀出來，并根據(jù)目的蛋白所在的位置選擇保留上清還是沉淀。差速分離最常見的實(shí)際應(yīng)用是通過其他手段濃縮和純化上清液中的病毒之前，用差速離心法去除病毒裂解物中的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。通過差速離心法能夠?qū)⒉《倦x心沉淀與小顆粒的雜質(zhì)分開，但是在沉淀或重懸過程中，病毒的結(jié)構(gòu)可能會(huì)被破壞;此外一些病毒沉淀后難以再溶解，這就影響后續(xù)的純化或分析。如果要得到活性和結(jié)構(gòu)良好、分散均一并且純度較高的病毒樣品，那么就應(yīng)該考慮密度梯度離心法。

　　Kaaden O R等[2]人先用PEG沉淀法(PEG 6000、8-10%(W/V)濃度)從BHK-21型細(xì)胞病毒養(yǎng)液中對(duì)口蹄疫病毒(FMDV)進(jìn)行預(yù)處理，然后采用蔗糖密度梯度離心，得到高純度的口蹄疫病毒。Barzilai R[3]等人通過氯化銫密度梯度離心，直接從細(xì)胞質(zhì)裂解液中獲得了FMDV純品，回收率達(dá)到95%。但超速離心存在操作繁瑣、離心時(shí)間長(zhǎng)、重復(fù)性差、設(shè)備成本高、處理量小、不易于放大等問題，只適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的病毒純化和分析，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

　　新型疫苗純化技術(shù)

　　層析技術(shù)具有分辨率高、操作條件溫和、重復(fù)性好、易于放大、分離系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)管道化和自動(dòng)化(更好滿足密閉無菌要求)等突出優(yōu)勢(shì)，在生物制品(重組蛋白、疫苗、抗體等)的分離純化中扮演著極其重要的角色。層析技術(shù)應(yīng)用廣泛，在疫苗純化中已有大量成功的案例，絕大多數(shù)人用疫苗(乙肝疫苗、百日咳疫苗、狂犬疫苗等)都采用層析技術(shù)進(jìn)行純化和大規(guī)模生產(chǎn)[3]。

　　層析技術(shù)根據(jù)分離原理的不同，主要包括凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析和親和層析4大類。各種層析技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用情況如表1所示，其中離子交換層析技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛。

　　表1.層析技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用情況

層析技術(shù)特點(diǎn)捕獲?精純?精制離子交換高分辨率、高載量、高流速；低鹽上樣*********臺(tái)風(fēng)（TY）高分辨率、中等載量、高流速；高鹽上樣******凝膠過濾高分辨率；低載量、低流速-****親和高分辨率、中/高載量、高流速********

　　隨著市場(chǎng)需求的擴(kuò)大、研發(fā)機(jī)構(gòu)及疫苗廠家的研發(fā)投入和技術(shù)積累，越來越多的獸用疫苗開始使用層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，工藝開發(fā)和小批量制備取得了重要進(jìn)展，部分產(chǎn)品已進(jìn)入后續(xù)的中試放大階段。中科院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室是我國(guó)分離純化領(lǐng)域的知名機(jī)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)單位，擁有一支高水平的人才隊(duì)伍、配置齊全的分離純化和分析檢測(cè)平臺(tái)，在人用疫苗領(lǐng)域具有10多年的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化經(jīng)驗(yàn)(與企業(yè)合作)。近年來在獸用疫苗的分離純化、分析檢測(cè)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究等領(lǐng)域也開展了一系列富有成效的工作[4-7]。

　　蘇志國(guó)、張松平等[4]通過對(duì)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的研究、培養(yǎng)液中雜質(zhì)的組成和特性分析，在對(duì)介質(zhì)選型、操作條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了1條由離子交換層析和凝膠過濾層析組成的分離純化工藝，口蹄疫滅活病毒的純化倍數(shù)達(dá)到217倍，純度達(dá)到95%以上，收率為37.5%。為提高疫苗的收率和降低純化成本，又進(jìn)一步研究疏水層析技術(shù)在口蹄疫病毒分離純化中的應(yīng)用效果，最終建立的由疏水層析、超濾濃縮和凝膠過濾層析組成的分離純化工藝，取得了更好的分離純化效果，純化倍數(shù)達(dá)到247倍，收率達(dá)到75.4%，純度接近電泳純;該工藝進(jìn)一步提高了疫苗收率，更有利于提高純化效率和降低疫苗的純化成本，為大規(guī)模制備口蹄疫滅活病毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

　　圖1：丁基疏水層析分離純化FMDV層析譜圖

　　圖2 ：凝膠過濾層析精制純化FMDV層析譜圖

　　圖3：圖3 SDS-PAGE和Western blot分析(1、FMDV培養(yǎng)液，2、HIC初純樣品，3、超濾濃縮樣品，4、凝膠過濾樣品;5、凝膠過濾樣品的VP1條帶進(jìn)行Western blot分析)

　　除了滅活病毒疫苗，基因工程重組疫苗(重組蛋白抗原或重組融合(標(biāo)簽)蛋白抗原)也可以有效抑制病毒感染，有望發(fā)展成為更為安全有效的疫苗品種。基因工程重組疫苗，特別是帶有標(biāo)簽的重組疫苗，分離純化難度大大降低，分離效率大大提高。熊毅等[8]分別構(gòu)建了帶His和GST標(biāo)簽的重組表達(dá)載體，成功表達(dá)了A型口蹄疫病毒(FMDV)的結(jié)構(gòu)蛋白VP1(包涵體形式)，并分別采用金屬螯合層析和GST親和層析進(jìn)行純化，得到電泳純的VP1蛋白;活性鑒定結(jié)果表明重組蛋白具有良好的特異性和抗原性，可用于易感動(dòng)物的免疫及血清抗體篩查。

　　疫苗檢測(cè)技術(shù)

　　分析檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于疫苗培養(yǎng)、純化、質(zhì)控的各個(gè)階段。快速、準(zhǔn)確地對(duì)疫苗進(jìn)行分析表征，對(duì)于疫苗分離純化工藝的開發(fā)和優(yōu)化，意義重大。人用疫苗研究歷史悠久、技術(shù)完善，相關(guān)技術(shù)都可以直接用于獸用疫苗的分析檢測(cè)。疫苗表征內(nèi)容主要包括純度、結(jié)構(gòu)和活性;相應(yīng)的分析檢測(cè)技術(shù)主要包括電泳(以及Western blot)、ELISA、高效液相色譜、超速離心、動(dòng)態(tài)光散射、透射電鏡、差示掃描量熱等技術(shù)[4-8]。

　　表2 疫苗分析檢測(cè)技術(shù)技術(shù)名稱特點(diǎn)?應(yīng)用?電泳?操作簡(jiǎn)單，定性半定量?純度、分子量ELISA體外活性?活性表征高效液相色譜快速、準(zhǔn)確純度、顆粒大小、分子量場(chǎng)流分級(jí)無損傷表征疫苗真實(shí)結(jié)構(gòu)純度、顆粒大小、分子量高效液相色譜分析速度慢、操作繁瑣純度動(dòng)態(tài)光散射快速、準(zhǔn)確顆粒大小和分布高效液相色譜方便快捷直觀昂貴分子大小和形貌差示掃描量熱快速、疫苗穩(wěn)定性條件篩選結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

　　在上述分析檢測(cè)技術(shù)中，疫苗結(jié)構(gòu)及其變化的表征對(duì)于疫苗分離純化工藝和產(chǎn)品保存穩(wěn)定性的研究越來越引起研究者的關(guān)注。高效液相色譜(或場(chǎng)流分級(jí))與光散射技術(shù)(如多角度激光)聯(lián)用，廣泛用于各種疫苗的顆粒大小、分子量，以及結(jié)構(gòu)變化的表征[4, 6, 7]。差示掃描量熱技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于疫苗穩(wěn)定性研究中，無論是分離純化過程中疫苗穩(wěn)定結(jié)構(gòu)條件(溫度、緩沖液(pH、鹽種類和濃度)、添加劑等)的篩選，還是疫苗成品的制劑研究[5]。　　

　　結(jié)論與展望

　　我國(guó)獸用疫苗市場(chǎng)潛力巨大，未來一段時(shí)間都將保持高速發(fā)展的態(tài)勢(shì)。近年來，疫苗品質(zhì)不斷提高，市場(chǎng)逐步由政府招標(biāo)向市場(chǎng)化轉(zhuǎn)變，因此，疫苗分離純化必將成為今后疫苗發(fā)展的重要趨勢(shì)，只有經(jīng)過濃縮、純化等技術(shù)處理的高品質(zhì)疫苗，才有可能在越來越激烈的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中占有一席之地。

　　單從技術(shù)層面來看，獸用疫苗和人用疫苗的分離純化與分析檢測(cè)技術(shù)是相通的。目前廣泛用于各種人用疫苗分離純化和分析檢測(cè)的技術(shù)都可用于獸用疫苗研發(fā)和生產(chǎn)中。但在市場(chǎng)價(jià)格方面，與人用疫苗相比，獸用疫苗市場(chǎng)價(jià)格相對(duì)較低，因此獸用疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)分離純化技術(shù)及成本控制的要求也極為苛刻。如何借鑒人用疫苗的分離純化技術(shù)和成功經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)和簡(jiǎn)化純化工藝、提高疫苗穩(wěn)定性和疫苗收率、降低介質(zhì)等關(guān)鍵材料的使用成本，對(duì)于高端獸用疫苗的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化，意義重大。

　　作者介紹：黃永東，博士，中科院過程工程研究所副研究員，長(zhǎng)期致力于蛋白質(zhì)分離純化工藝研發(fā)和層析分離介質(zhì)研制工作。先后主持了9項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等課題，以及多項(xiàng)和生物醫(yī)藥企業(yè)的合作課題;先后開發(fā)了乙肝疫苗、百日咳疫苗、胸腺肽等多種生物活性物質(zhì)的分離純化工藝，以及10多種層析分離介質(zhì)，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品在200多家科研單位和企業(yè)得到應(yīng)用。在純化工藝開發(fā)和介質(zhì)篩選等方面具有高超的理論水平和豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1] 武桂梅, 何玉友, 王振輝, 李鵬, 鄭洪娟. 膜分離法純化濃縮豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒的效果試驗(yàn). 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2015, 51 (9): 99-102.

　　[2] Kaaden OR, Dietzschold B, Matheka HD, Tokui T. Konzentrierung und Reinigung von Maul-und-Klauenseuche-(MKS-) Virus durch Poly?thylenglykol (PEG). Archiv für die gesamte Virusforschung, 1971. 35(1): 104-113.

　　[3] Barzilai R, Lazarus L H, Goldblum N. Viscosity-Density Gradient for Purification of Foot-and-Mouth Disease Virus. Archly für die gesamte Virusforschung, 1972, 34: 141-146.

　　[4] Li H, Yang YL, Zhang Y, Zhang SP, Zhao Q, Zhu YY, Zou XQ, Yu MR, Ma GH, Su ZG. A hydrophobic interaction chromatography strategy for purification of inactivated foot and mouth disease virus. Protein Expression and Purification, 2015, 113: 23-29.

　　[5] Yang YL, Zhao QZ, Li ZJ, Sun LJ, Ma GH, Zhang SP, Su ZG. Stabilization study of inactivated foot and mouth disease virus vaccine by size-exclusion HPLC and differential scanning calorimetry. Vaccine, 2017, 35: 2413-2419.

　　[6] Chen Y, Zhang Y, Zhou YF, Luo J, Su ZG. Asymmetrical flow field-flow fractionation coupled with multi-angle laser light scattering for stability comparison of virus-like particles indifferent solution environments. Vaccine, 2016, 34: 3164-3170.

　　[7] Yang YL, Li H, Li ZJ, Zhang Y, Zhang SP, Chen Y, Yu MR, Ma GH, Su ZG. Size-exclusion HPLC provides a simple, rapid, and versatile alternative method for quality control of vaccines by characterizing the assembly of antigens. Vaccine 33 (2015) 1143–1150

　　[8] 顏健華, 何奇松, 蔣家霞, 馮淑萍, 黃勝斌, 韋達(dá)有, 易春華, 許瑞勝, 梁晟, 熊毅. A型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的原核表達(dá)、純化及鑒定. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 47 (2): 301-305.