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外

2017

諾貝爾化學(xué)獎

2017年諾貝爾化學(xué)獎授予了理查德·亨德森（richard henderson）、約阿希姆·弗蘭克（joachim frank）和雅克·杜博歇（jacques dubochet），表彰他們在冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展上做出的卓越貢獻(xiàn)。

分辨率對比

他們將冷凍電鏡技術(shù)簡化，并將其應(yīng)用在生物分子成像方向，打破了長期以來解析蛋白必須依靠傳統(tǒng)x射線晶體學(xué)（x-raycrystallography），核磁共振(nmr)的手段，使我們在近期內(nèi)很有可能獲得原子級別分辨率下的生命復(fù)雜機(jī)制的詳細(xì)圖像。（圖片來源：martin hogbom）

其中，尤其值得一提的是杜博歇教授的工作: 他將少量蛋白溶液滴加到銅網(wǎng)上，迅速插入到用液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，使蛋白顆粒迅速被制冷的玻璃態(tài)的冰所包裹，最大程度上保存了蛋白顆粒的真實(shí)原始狀態(tài)，得到了高質(zhì)量的冷凍電鏡樣品，從而大大推動了冷凍電鏡的推廣。

既然冷凍樣品制備如此重要，有沒有儀器可以提高我們實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和成功率呢？有！那就是我們徠卡的載網(wǎng)投入冷凍儀gp。leica em gp設(shè)計(jì)用于冷凍電鏡樣品前處理，用于制備玻璃化的液態(tài)樣品。如病毒顆粒，蛋白質(zhì)及其他細(xì)胞組分等的樣品懸液。

冷凍電鏡技術(shù)未來之路在何方??
celluar cryoem

除

了蛋白等生物大分子外，生物樣品還有很重要的一面是細(xì)胞和組織。即使目前很多重要的蛋白結(jié)構(gòu)都得到了埃米級別的解析，但由于它們都是純化出來的，已經(jīng)脫離了原來位置，如同一片樹葉脫離了大樹，研究的再深刻，目前也只是一葉遮目，不要說推測這片樹葉在森林里的位置，即使在哪顆特定大樹上的生長部位和結(jié)構(gòu)都很難說。因此解析細(xì)胞或組織這樣大尺度的高分辨精細(xì)結(jié)構(gòu)具有更廣泛的生物學(xué)意義。

那我們對于它們的制樣手段研究進(jìn)展如何？這又不得不提這次諾獎的杜博歇教授。他不僅建立了單顆粒冷凍制樣技術(shù)，同時也在細(xì)胞組織層面做出了突出的貢獻(xiàn)，尤其是cemovis(cryo-electron microscopy of vitreous sections)的發(fā)展和逐漸完善，實(shí)現(xiàn)了近生理狀態(tài)的細(xì)胞組織的原位觀察。cemovis沒有化學(xué)固定，沒有染色，也沒有生物成分的聚集；保持了生物體內(nèi)水分的原位，玻璃態(tài)的固定。應(yīng)用cemovis得到的電鏡圖片看起來和常規(guī)制樣圖片有很大不同：結(jié)構(gòu)更平滑均質(zhì)，細(xì)節(jié)更多更明顯。那么它的技術(shù)路線是什么呢？高壓冷凍+冷凍切片+冷凍電鏡。杜博歇教授初期的工作就有用徠卡的em pact（徠卡第一代高壓冷凍儀）對樣品進(jìn)行冷凍，用fcs ultracut s cryomicrotome（徠卡早期冷凍切片機(jī)）進(jìn)行冷凍切片，最后在冷凍透射電鏡下觀察（見下圖）。

作為高壓冷凍領(lǐng)域的領(lǐng)跑者，徠卡迄今已經(jīng)發(fā)展到第三代高壓冷凍儀-ice(innovative cryo-fixation equipment)。高壓冷凍儀是通過液氮制冷，通過空氣壓縮機(jī)提供壓力來源，通過物理原理可使局部壓強(qiáng)達(dá)到2100拔，從而實(shí)現(xiàn)對含水樣本的高壓冷凍固定, 冷凍固定后樣品經(jīng)后續(xù)處理（冷凍替代/常溫超薄切片，冷凍超薄切片或冷凍斷裂等）供電子顯微鏡觀測。

高壓冷凍儀能在毫秒級別內(nèi)最大程度地保存樣品生活狀態(tài)的原始真實(shí)信息，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶/抗原活性無變化，可溶性離子及小分子得到有效固定等等，有效避免了常規(guī)化學(xué)固定帶來的假象。

除了可以結(jié)合冷凍切片，完成cemovis的工作外，它還可以結(jié)合冷凍斷裂，冷凍替代等來觀察樣品的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)或進(jìn)行免疫學(xué)的相關(guān)工作。除此之外，它還可以結(jié)合光刺激和電刺激，為神經(jīng)生理學(xué)家打開了一扇新的大門。

現(xiàn)在，冷凍制樣逐漸深入人心，那冷凍好的樣品，經(jīng)過處理，能否在光鏡下同時實(shí)現(xiàn)其功能的探究呢？

徠卡em cryo clem（cryo correlative light electron microscopy）冷凍光鏡電鏡聯(lián)用系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)保持樣品原生狀態(tài)下的光鏡和電鏡圖像關(guān)聯(lián)分析，對同一樣品位置集熒光顯微圖像與高分辨率電鏡圖像于一體。

它的主要技術(shù)路線是： 通過冷凍制樣技術(shù)（高壓冷凍，保存樣品最原始的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息），制備得到冷凍超薄切片（或通過投入冷凍技術(shù)冷凍樣品），之后借助冷凍光鏡觀察熒光標(biāo)記位置，記錄感興趣的位置，然后在冷凍tem中實(shí)現(xiàn)原位電鏡觀察，從而實(shí)現(xiàn)光鏡電鏡聯(lián)用技術(shù)。

備注：高壓冷凍和冷凍超薄切片，用于冷凍固定組織樣品，例如侵染有病毒的組織樣品。投入冷凍em gp，用于冷凍單顆粒病毒大分子，或蛋白質(zhì)大分子顆粒。

此刻，無論是正在做單顆粒的你，還是正在做細(xì)胞組織的他，要不要來試試我們徠卡的gp，ice和cryo clem呢？

快撥打400-630-5902聯(lián)系我們吧！

至真圖片，制樣為先！

愿我們徠卡顯微系統(tǒng)祝您一臂之力！

關(guān)于徠卡顯微系統(tǒng)leica microsystems

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徠卡顯微系統(tǒng)是全球顯微科技與分析科學(xué)儀器之領(lǐng)導(dǎo)廠商，總部位于德國維茲拉(wetzlar, germany)。主要提供顯微結(jié)構(gòu)與納米結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域的研究級顯微鏡等專業(yè)科學(xué)儀器。自公司十九世紀(jì)成立以來，徠卡以其對光學(xué)成像的極致追求和不斷進(jìn)取的創(chuàng)新精神始終得到業(yè)界廣泛認(rèn)可。徠卡在復(fù)合顯微鏡、體視顯微鏡、數(shù)碼顯微系統(tǒng)、激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)、電子顯微鏡樣品制備和醫(yī)療手術(shù)顯微技術(shù)等多個顯微光學(xué)領(lǐng)域處于全球領(lǐng)先地位。

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