轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測

  利用PCR可以快速鑒定轉(zhuǎn)基因植物，它具有所需轉(zhuǎn)基因植物基
因組DNA起始量少、快速、準(zhǔn)確及鑒定轉(zhuǎn)基因植物數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)。
但要嚴(yán)格設(shè)置以野生型植物的基因組DNA為模板作為陰性對照，以
含有目的基因質(zhì)粒為模板作為陽性對照，以求獲得真實可靠的鑒定
結(jié)果。
  PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測在預(yù)計的分子質(zhì)量處出現(xiàn)單一DNA條帶，但
常常呈現(xiàn)含有明顯條帶的彌散區(qū)帶，這在以核基因組DNA作模板時
常會出現(xiàn)，可能的原因有核基因組復(fù)雜度高、退火溫度低、延伸時
間長、引物和模板量大等。

  RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。因為RNA酶含
有肽鏈內(nèi)二硫鍵，使其能抵抗長時間的煮沸和溫和變性劑，變性后
也可迅速折疊，具有很高的穩(wěn)定性。該酶的活性不依賴二價陽離子
激活，難以因金屬離子螯合劑(EDTA)失活。RNA酶可耐受多種處理(
如煮沸、酸、堿)而不失活。RNase存在廣泛，環(huán)境中的灰塵、各種
實驗器皿和試劑、人體的汗液和唾液中均存在RNA酶。目前，尚無
使RNA酶失活的簡易辦法。

提取RNA包括破碎細(xì)胞，用酸性酚、SDS等蛋白質(zhì)變性劑將RNA與蛋
白質(zhì)分開，抑制內(nèi)源的RNA酶，同時去除DNA、糖類、鹽類等雜質(zhì)，
最后純化出RNA等步驟。由于RNA絕大多數(shù)以與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白
體的形式存在，所以要使蛋白質(zhì)變性與RNA分離。根據(jù)DNA與RNA在
不同pH下穩(wěn)定性不同，使提取環(huán)境保持酸性可以防止RNA被降解。

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