利用電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中蛋白質(zhì)

采用生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和電子顯微技術(shù)
對蛋白質(zhì)定向、轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運的機制已進行了廣泛研究。本章將涉及
用于蛋白質(zhì)輸出的研究技術(shù)。我們將這些技術(shù)分為四類：細(xì)胞內(nèi)、
遺傳學(xué)、細(xì)胞外和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)。當(dāng)檢驗一種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞
內(nèi)的運動時，細(xì)胞內(nèi)技術(shù)是必需的，并且常常使用遺傳學(xué)方法來識
別突變體。遺傳學(xué)技術(shù)是細(xì)胞內(nèi)技術(shù)的分支，它在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運研究
領(lǐng)域中起著最重要的作用。遺傳學(xué)技術(shù)已揭示了許多在蛋白質(zhì)輸出
過程中轉(zhuǎn)運復(fù)合體的蛋白質(zhì)組分。細(xì)胞外技術(shù)也起到重要作用，它
用于確定被純化蛋白質(zhì)的功能，目的在于通過實驗重現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運
的過程。應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，已可利用電子顯微鏡和熒光顯微鏡
觀察一個蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的運動。

  真核細(xì)胞細(xì)胞器和細(xì)胞膜的分離

  采用生物化學(xué)方法確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞器上的準(zhǔn)確定位需要破
壞細(xì)胞形態(tài)，且需要將膜分離出來，因為真核細(xì)胞含有許多不同的
膜。這些膜包括質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜、高爾基復(fù)合體膜、過氧化
物酶體膜、溶酶體膜、線粒體膜，以及植物細(xì)胞中葉綠體膜和葉綠
體中的類囊體膜。已有證據(jù)表明膜定位是蛋白質(zhì)共定位到其目標(biāo)膜
上的過程。為了分離細(xì)胞器，首先要用盡可能溫和的方法使細(xì)胞破
碎。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，又稱微體，通常用Potter-Elvehjem勻漿機將狗的
胰腺勻漿，然后在低速離心下沉淀微體，再通過凝膠過濾柱進行過
濾。用各細(xì)胞器的標(biāo)志酶來鑒定其分離純度。
  細(xì)胞內(nèi)研究·用藥物和Sec突變體可揭示膜轉(zhuǎn)位是否需要質(zhì)子動
力勢能以及Sec蛋白的作用?！さ鞍酌概c膜的接觸以及信號肽加工
方面的研究為跨越細(xì)菌和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)定位提供確定方法?！?br>天冬氨酸連接的寡糖修飾可用于跟蹤在分泌途徑中的糖蛋白定位。
·通過確定輸出蛋白質(zhì)是否與相應(yīng)亞細(xì)胞組分一同被分離，可監(jiān)測
該蛋白質(zhì)是否
  定向到細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)或液態(tài)組分。

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