關(guān)于NK細胞培養(yǎng)的問題，不能只認為培養(yǎng)基不好或試劑盒不好，很多客戶在培養(yǎng)過程中遇到接種密度的問題、補液程序的問題、血漿問題以及樣本的問題，所以影響NK細胞培養(yǎng)效果的因素非常之多，那么在細胞培養(yǎng)不太滿意的情況下，我們應該按以下原則進行排查。
 

1、血液樣本問題

首先確認樣本的狀態(tài)，理論上來講外周血樣本應在抽取的6個小時內(nèi)進行細胞分離，這個時段細胞是處于最好的狀態(tài)，所以培養(yǎng)前請確認樣本是否新鮮，以及血液是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象

血液樣本保存時間過長，會導致單核細胞無法成功誘導激活。

血液如在運送過程中溶血，則可能導致血漿分離出現(xiàn)問題，無法后期培養(yǎng)添加。

如用凍存的單個核細胞復蘇培養(yǎng)，請確認復蘇單個核細胞的活率及狀態(tài)。
 

2、接種密度問題

請確保接種的密度在1.5-2x106cells/m L，過低密度會導致細胞前期增殖緩慢，無法達到補液要求。
 

3、血漿的處理及添加方式

（1）血漿必須要56℃滅活30min，除去多余的纖維蛋白，如有可能冷凍后離心，保證細胞培養(yǎng)時添加的血漿不會有纖維蛋白析出粘連正常細胞。

（2）如有可能有更多剩余的血漿，可在后期補入，對于有些狀態(tài)較差的樣本會有更好的培養(yǎng)效果。
 

4、補液原則問題

NK培養(yǎng)受樣本差異性影響會很大，所以沒有一個固定的補液程序可以指導各種不同的樣本。

有的樣本激活迅速，生長快速，補液就相對容易，也更好擴增，可有的樣本前期就長的較慢，如遇到腫瘤患者晚期年老的病人，更是難上加難，所以針對不同的樣本，我們應該有不同的應對原則：

（1）首先7天以后的補液原則是補液后細胞密度應在0.5-0.8x106cells/m L，如密度達不到，請延遲一天后再進行補液，否則當你細胞補液密度過低時，好的樣本可以長起來，那差的樣本就會逐漸凋亡，無法繼續(xù)培養(yǎng)。

（2）對于差的樣本，適當增加血漿的添加次數(shù)，可以得到更好的效果，比如標準程序需要加3-4次血漿，那么有可能的話你可以加到5次。
 

5、操作原因

（1）補液培養(yǎng)基的溫度

培養(yǎng)基補液前應提前預溫，過冷的培養(yǎng)基會導致細胞應激反應，出現(xiàn)絮狀物；

（2）培養(yǎng)箱環(huán)境的劇烈變化

培養(yǎng)箱異常，溫度及二氧化碳濃度變化較大會導致細胞死亡，出現(xiàn)絮狀物；

（3）細菌、真菌、支原體污染

受到細菌、真菌、支原體污染的細胞生長非常緩慢，甚至不生長；

（4）因子試劑盒經(jīng)過了反復的凍融

反復凍融會大大降低因子的活性，激活、誘導、擴增等環(huán)節(jié)都會出現(xiàn)問題，達不到最優(yōu)的效果。