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國自然沖刺2:蛋白翻譯后修飾的基金申請解析與研究注意點(diǎn)——中國生物器材網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-03-08  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):1025

每年三月初,都是科研界的 高考 倒計(jì)時(shí),因?yàn)榫嚯x國自然基金申請的截止日期已不到半月。縱觀歷年國自然申請情況,蛋白的翻譯后修飾都是申請中重大研究方向之一。2018年國自然統(tǒng)計(jì)表明,磷酸化、泛素化、乙?;刃揎椀南嚓P(guān)基金項(xiàng)目,總研究資助金額超過2億。

繼上周的腸道微生物研究方案解析后(國自然沖刺:打通菌群多樣性與功能的研究策略),本周我們再抓緊時(shí)間為各位老師分享一下國自然中各類修飾的趨勢分析及組學(xué)研究的注意事項(xiàng),以期為各位老師提供幫助。下面我們主要關(guān)注三種最常規(guī)研究的修飾類型 磷酸化修飾、泛素化修飾和乙?;揎?。

表現(xiàn)穩(wěn)定:磷酸化 全能調(diào)控之王

磷酸化是修飾中的全能調(diào)控之王,其研究最早,且分布廣,修飾量最多。在真核細(xì)胞中,約1/3的蛋白隨時(shí)都可以被磷酸化,幾乎參與所有的生理、病理過程。因此,磷酸化修飾是所有修飾中最被廣泛認(rèn)知和重點(diǎn)研究的。

▲ 磷酸化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

綜上這些特點(diǎn),在國自然基金申請中,與磷酸化、激酶相關(guān)的研究歷年所獲的資助項(xiàng)目數(shù)目均較多、且金額較高。然而,其成熟的研究基礎(chǔ)也使得其每年的基金資助趨勢穩(wěn)定平緩。2018年的基金統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,與磷酸化相關(guān)的項(xiàng)目數(shù)有105個(gè),資助金額4768萬,而與激酶相關(guān)的項(xiàng)目數(shù)140個(gè),資助金額高達(dá)6414.9萬,其中重點(diǎn)項(xiàng)目有2個(gè)。因此,磷酸化可以說是修飾的基金申請中一個(gè)表現(xiàn)非常穩(wěn)定的方向。

圖1.國自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-磷酸化

▲ 磷酸化修飾組學(xué)研究方案的技術(shù)注意點(diǎn):

● 磷酸化修飾肽段富集方法如何選擇?

由于發(fā)生磷酸化修飾的氨基酸有三種--絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸,故根據(jù)研究目的的不同,磷酸化修飾肽段的富集方法也不同。目前,比較成熟的磷酸化富集方法主要有:金屬螯合物富集(如TiO2、IMAC富集)和抗體富集兩類。

對于三種氨基酸位點(diǎn)上的修飾均關(guān)注的老師來說,金屬螯合物富集是最常用的富集介質(zhì)。其富集效率較高,通??梢赃_(dá)到90%以上,其中一些商品化的IMAC試劑盒具備很理想的富集穩(wěn)定性。

而對于重點(diǎn)關(guān)注酪氨酸磷酸化修飾變化的老師來說(比如說不少關(guān)注腫瘤領(lǐng)域中受體酪氨酸激酶研究的方向),使用TiO2、IMAC則無法滿足要求了,這是由于酪氨酸磷酸化的修飾比例非常低,僅占所有蛋白質(zhì)磷酸化比例的1%。因此,針對這類分析,往往采用酪氨酸特異性基序的抗體進(jìn)行富集,才能獲得最佳結(jié)果(中科新生命(APT)采用抗體界的金標(biāo)準(zhǔn)--CST的抗體進(jìn)行酪氨酸磷酸化的富集)。

● 對于后續(xù)結(jié)果驗(yàn)證或者靶向檢測的研究目的,如果沒有修飾位點(diǎn)的抗體該怎么辦?

基于質(zhì)譜的PRM技術(shù)是修飾組后續(xù)驗(yàn)證或目標(biāo)位點(diǎn)靶向檢測的最佳選擇之一。PRM驗(yàn)證全稱是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率質(zhì)譜發(fā)展的靶向定量技術(shù)。由于其只針對特定目標(biāo)信號進(jìn)行掃描,可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白、修飾位點(diǎn)的精準(zhǔn)定量,其應(yīng)用目的類似于Western blot。 

PRM已逐漸被業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可和關(guān)注,Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究應(yīng)用。此外,PRM可同時(shí)對多個(gè)蛋白、修飾位點(diǎn)進(jìn)行定量,相比傳統(tǒng)的WB,不僅更準(zhǔn)確、精細(xì)而且更高效。目前,中科新生命已推出磷酸化修飾組+PRM驗(yàn)證一站式服務(wù),幫助老師快速解決驗(yàn)證之憂。

● 磷酸化修飾組對樣本量的要求如何?

 

   

勢頭正猛:泛素化 蛋白表達(dá)調(diào)控研究的新角度

泛素化是所有修飾中最為特別的一類修飾,由于發(fā)生泛素化修飾的蛋白往往會(huì)進(jìn)一步通過蛋白酶體發(fā)生降解(也有一部分會(huì)發(fā)揮腳手架的作用促進(jìn)蛋白復(fù)合體形成等),因此,蛋白表達(dá)水平變化往往是泛素化修飾的重要關(guān)注點(diǎn)。泛素化修飾與轉(zhuǎn)錄、蛋白水平研究同樣重要的,都是調(diào)控蛋白表達(dá)水平的重要機(jī)制之一,但卻往往被研究人員所忽略,其具備相對較高的研究創(chuàng)新性。

▲ 泛素化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

從歷年的基金申請情況看,泛素化修飾所申請項(xiàng)目數(shù)與金額自2013年后每年均呈現(xiàn)快速增長趨勢,而且2017年-2018年的增長速度為歷年最快。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,2018年泛素化研究的資助項(xiàng)目達(dá)137個(gè),資助金額共6680.45萬,其中重點(diǎn)項(xiàng)目有5個(gè)。

由此可見,泛素化相關(guān)基金無論是申請項(xiàng)目數(shù)還是金額數(shù)均在向磷酸化逼近,甚至從重點(diǎn)項(xiàng)目數(shù)看,18年泛素化的項(xiàng)目數(shù)已然超過了磷酸化。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)表明,泛素化研究資助項(xiàng)目在醫(yī)學(xué)部中一共98項(xiàng),總資助金額高達(dá)4700萬元。由此可見,泛素化的相關(guān)研究正是科研界的 當(dāng)紅小生 ,基金申請的一大熱點(diǎn)。

圖2.國自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-泛素化

除基金之外,近幾年,泛素化更是頻頻出現(xiàn)在各大CNS頂級雜志上,成為CNS雜志綜述討論的熱點(diǎn)話題,從各種生理過程、到腫瘤、衰老等疾病、再到藥物開發(fā)??梢?,其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要作用、巨大潛力越來越得到重視,并有望成為繼磷酸化之后的第二大明星修飾類型。

▲ 泛素化修飾組研究方案的技術(shù)注意點(diǎn):

● 泛素化修飾肽段富集的選擇?

目前,泛素化修飾肽段的富集還是采用基于賴氨素修飾基序抗體(K-GG)進(jìn)行富集(同樣,中科新生命是采用來自CST公司的抗體進(jìn)行富集)。

● 泛素化修飾組的結(jié)果如何解讀?后續(xù)驗(yàn)證有什么注意點(diǎn)?

由于泛素化修飾的蛋白很可能涉及后續(xù)的蛋白降解,因此各位老師在拿到泛素化組的數(shù)據(jù)時(shí),如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果中呈現(xiàn)出泛素化修飾的表達(dá)減少,不要認(rèn)為一定是泛素化修飾水平降低了!其既有可能是修飾水平降低了也有可能是修飾水平增加了,這是泛素化修飾與其他修飾的結(jié)果解讀非常不同的地方。因?yàn)榉核鼗揎椩黾涌芍苯訉?dǎo)致蛋白降解,所以蛋白若是發(fā)生了泛素-蛋白酶體降解,其修飾量也是隨著蛋白降解而降低的。因此,對于進(jìn)行細(xì)胞水平研究的老師而言,我們建議需要用MG132預(yù)先處理細(xì)胞,抑制泛素酶體的降解過程。對于泛素化修飾的后續(xù)驗(yàn)證,不僅要驗(yàn)證修飾水平的變化,還要再進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證分析。

● 泛素化修飾組對樣本量的要求如何?

推薦:常規(guī)動(dòng)物組織樣本120mg-2g;常規(guī)植物組織樣本500mg-2g;細(xì)胞樣本1-5 10^8個(gè)細(xì)胞

另辟蹊徑:乙酰化修飾----代謝表現(xiàn)背后的調(diào)控機(jī)制

相對于磷酸化、泛素化而言,乙?;芯扛鼘﹃P(guān)注于其對組蛋白的表觀調(diào)控,而非組蛋白上的乙?;揎梽t相對較少。尤其是乙?;瘜Υx過程的廣泛調(diào)控作用,更是近些年才被認(rèn)知的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。

▲ 乙酰化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

從歷年的基金申請情況看,乙?;揎棻憩F(xiàn)絲毫不落后,其相關(guān)研究所申請到的項(xiàng)目數(shù)、金額均呈現(xiàn)逐年增加的趨勢,而且,在近兩年(2016年-2018年)的增加速度最快。2018年,乙?;芯康馁Y助項(xiàng)目有111個(gè),資助金額共5426萬,重點(diǎn)項(xiàng)目2個(gè)。其中,醫(yī)學(xué)部的乙?;芯抠Y助項(xiàng)目占48項(xiàng),共3800萬元資助。

圖3.國自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-乙酰化

實(shí)際上,乙酰化的研究已有50年,除了發(fā)生于組蛋白,還有有大量的乙?;揎椀鞍状嬖谟诩?xì)胞漿、線粒體等中,其對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬等生物功能有廣泛的調(diào)控作用。2009年,SCIENCE同時(shí)發(fā)表兩篇研究,把乙?;芯繋氲揭粋€(gè)新高度。其中一篇SCIENCE報(bào)道,在肝臟中發(fā)現(xiàn)了超過1000個(gè)乙?;鞍踪|(zhì),且代謝酶上普遍發(fā)生這樣的修飾,至此,乙?;{(diào)控代謝成為了編入教科書級的發(fā)現(xiàn),代謝表型背后的調(diào)控機(jī)制--乙?;?,成為了代謝調(diào)控研究的新領(lǐng)域。這幾年的nature reviews上,也是頻頻刊登 乙酰化調(diào)控代謝 的熱點(diǎn)綜述。

從組學(xué)的研究來看,乙?;{(diào)控代謝是從一個(gè)非常具有新穎性的切入角度,這個(gè)角度使得對乙?;δ艿奶剿鞑粌H僅局限于組蛋白上。因此,修飾組配合代謝組進(jìn)行研究,是打通機(jī)制與表型的研究策略,是一個(gè)更為完整、創(chuàng)新的國自然基金研究方案。

▲ 乙?;揎椊M研究方案的技術(shù)注意點(diǎn):

● 乙?;揎楇亩胃患绾芜x擇?對樣本量要求如何?

乙?;揎楇亩胃患饕捎觅嚢彼嵋阴;蚩贵w進(jìn)行富集(同樣,中科新生命使用CST公司的修飾抗體)。

● 若要進(jìn)行乙?;M+代謝組的聯(lián)合分析,對樣本有何要求?

對于聯(lián)合而言,保證兩個(gè)組學(xué)樣本間的一致性是關(guān)鍵。因此,乙?;c代謝聯(lián)合,我們推薦兩個(gè)組學(xué)的樣本來源均一致。如果有老師想要進(jìn)一步利用相關(guān)性分析進(jìn)行深入數(shù)據(jù)挖掘,兩個(gè)組學(xué)之間的樣本重復(fù)數(shù)目也要保持一致。

● 乙?;揎椊M對樣本量的要求如何?

推薦:常規(guī)動(dòng)物組織樣本120mg-2g;常規(guī)植物組織樣本500mg-2g;細(xì)胞樣本1-5 10^8個(gè)細(xì)胞

總 結(jié)

縱觀歷年國自然申請情況,修飾都是申請中重大研究方向之一。到2018年國自然,磷酸化、泛素化、乙?;?,每一類修飾類型的項(xiàng)目資助金額均超過5000萬,修飾方向的總研究資助金額超2億。

如今,隨著研究技術(shù)的發(fā)展,質(zhì)譜作為研究翻譯后修飾的最重要技術(shù)之一,越來越被廣泛的應(yīng)用于修飾的研究之中,也越來越能夠與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)契合,助力高層次的研究。

圖4.修飾組與傳統(tǒng)生物技術(shù)結(jié)合的完整研究思路

如果各位老師需要詳細(xì)的修飾組技術(shù)方法、資料,歡迎咨詢我們。

 
關(guān)鍵詞: 修飾 磷酸化 乙酰 研究 富集
 
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