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在New Brunswick S41i CO2恒溫?fù)u床內(nèi)采用透氣袋實(shí)現(xiàn)人類(lèi)T細(xì)胞快速擴(kuò)增
Amanda Suttle、 Stacey Willard、 Ma Sha
美國(guó)康涅狄格州恩菲爾德艾本德公司 聯(lián)系方式： sha.m@eppendorf.com
摘要
近年來(lái)細(xì)胞治療領(lǐng)域取得的進(jìn)步大大提升了對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)的需求。 T細(xì)胞必須能夠迅速擴(kuò)增， 才能在維持高存活率和T細(xì)胞屬性的同時(shí)達(dá)到高細(xì)胞密度。 攪拌罐生 物反應(yīng)器是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)增的最佳細(xì)胞培養(yǎng)工具之一。 然而， 在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)需接種大量細(xì)胞。 我們開(kāi)發(fā)出了利用透氣袋為臺(tái)式生物反應(yīng)器接種生產(chǎn) 足量T細(xì)胞的方法。
我們利用放置在New Brunswick S41i CO2恒溫?fù)u床內(nèi)的透氣袋進(jìn)行懸浮T細(xì)胞培養(yǎng)， 并測(cè)試了來(lái)自不同制造商的細(xì)胞培養(yǎng)袋， 最大灌注量從120 mL到5 L不等。 此外， 我們還測(cè)試了不同的振蕩速度， 以確定T細(xì)胞擴(kuò)增的最佳條件。 由于T細(xì)胞放置在固定平臺(tái)上無(wú)法生長(zhǎng)， 所以需要適當(dāng)?shù)恼袷帯?我們還探索了更傳統(tǒng)的利用振蕩搖瓶 進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方法。 結(jié)果表明， 使用透氣袋更為成功， 不到4天其擴(kuò)增量就超過(guò)了10倍， 而在搖瓶中則只擴(kuò)增了2 - 3倍。 綜上所述， 我們利用透氣袋和CO2恒溫?fù)u 床， 建立了一種在攪拌罐生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模制備培養(yǎng)T細(xì)胞的方法。
介紹
在過(guò)去的幾年里， 許多研究和開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室一直在研究可以實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞大量生長(zhǎng)的條件， 以支持細(xì)胞治療應(yīng)用對(duì)高質(zhì)量T細(xì)胞需求的增長(zhǎng)。 一直以來(lái)， 血庫(kù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行T 細(xì)胞培養(yǎng)的主要目標(biāo)都是維持細(xì)胞群以便后續(xù)輸注。 該技術(shù)尚無(wú)法滿(mǎn)足研發(fā)和商業(yè)使用所需的水平。 利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)法擴(kuò)增細(xì)胞是經(jīng)過(guò)充分論證的， 但還沒(méi)有 針對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行充分地優(yōu)化。 實(shí)際上， T細(xì)胞敏感而脆弱， 既往實(shí)驗(yàn)都證明很難為臺(tái)式生物反應(yīng)器接種生產(chǎn)足夠的細(xì)胞。
其他的懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 包括諸如干細(xì)胞等敏感細(xì)胞， 可以如前所示， 利用CO2控制的恒溫?fù)u床成功在搖瓶中培養(yǎng)[1]。 然而， 鑒于我們利用搖瓶法對(duì)原代人類(lèi)T細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的初步研究并未取得成功。 因此， 我們又開(kāi)發(fā)出了在New Brunswick S41i CO2恒溫?fù)u床（艾本德， S41I1200100） 中通過(guò)振蕩透氣袋來(lái)培養(yǎng)這些T細(xì)胞的 新方法。 該方法顯著優(yōu)化了T細(xì)胞培養(yǎng)， 得到了能夠?yàn)榕_(tái)式生物反應(yīng)器接種生產(chǎn)出足量T細(xì)胞的快速有效的初始擴(kuò)增條件。 例如， 在臺(tái)式研究中， 我們采用了一臺(tái) BioBLU 3c一次性罐（艾本德， 1386000300） ,設(shè)置為最大工作容積(3.75 L)， 目標(biāo)細(xì)胞接種密度為0.5 x 106 cells/mL， 則生物反應(yīng)器接種總共需要1.88 x 108個(gè)細(xì) 胞。 該研究還建立了低溫保存T細(xì)胞的方法， 這對(duì)此項(xiàng)研究至關(guān)重要。 通過(guò)建立低溫保存庫(kù)， 可將相同批次的細(xì)胞用于多個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
材料和方法
本研究采用一臺(tái)New Brunswick S41i Co2恒溫?fù)u床進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增操作， 所用設(shè)備和試劑的完整列表見(jiàn)表1。
表1： 本研究所用設(shè)備、 耗材和試劑列表
培養(yǎng)基配方和恒溫?fù)u床設(shè)置
本研究的完全培養(yǎng)基配方包括Lonza的X- VIVO 10基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含慶大霉素和酚紅）， 還添加了5%熱滅活人血清、 2 mM谷氨酰胺、 2 mM抗菌-抗真菌劑， 以及20 g/mL IL-2。
在所有研究中， S41i Co2恒溫?fù)u床都設(shè)置為5% CO2 水平。 將懸浮方瓶中生長(zhǎng)的T細(xì)胞培養(yǎng)物放置在靜置架上。 在Evolve袋中生長(zhǎng)的T細(xì)胞培養(yǎng)物則放置在振蕩平臺(tái) 上， 并利用膠帶將袋子各邊粘在平臺(tái)上將其固定（圖1）。 固定住袋子后， 將搖床設(shè)置為默認(rèn)的70 rpm振蕩速度（除非另有說(shuō)明）。 本研究的其余部分也采用該等設(shè)定 值和培養(yǎng)基配方。 如圖1所示， S41i Co2恒溫?fù)u床可用于多種不同的T細(xì)胞培養(yǎng)方法。
圖1： S41i恒溫?fù)u床能夠同時(shí)支持搖瓶、 懸浮T-25方瓶和細(xì)胞培養(yǎng)袋進(jìn)行T細(xì)胞培養(yǎng)
優(yōu)化Evolve透氣袋中的T細(xì)胞解凍和初始培養(yǎng)
我們對(duì)從STEMCELL Technologies購(gòu)得的一瓶原代人外周血全T細(xì)胞采用了兩 種不同的方法進(jìn)行了解凍， 兩種方法都使用了ThawSTAR CFT2自動(dòng)解凍儀對(duì)瓶 裝細(xì)胞進(jìn)行解凍操作。 STEMCELL Technologies建議將T細(xì)胞解凍至T-25方瓶， 并靜置兩天。 使用5 mL最大灌注量的新鮮完全培養(yǎng)基。 T細(xì)胞培養(yǎng)的頭兩天遵循 該方案， 然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Evolve袋中繼續(xù)培養(yǎng)。 為了確定實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長(zhǎng)和 存活率是否有必要采取靜置培養(yǎng)步驟， 我們?cè)u(píng)估了另一種方法， 即直接將瓶裝細(xì) 胞解凍至120 mL的Evolve細(xì)胞培養(yǎng)袋中。 在研究的這部分中采用的是80 mL工作 容積的Evolve袋。 使用Vi-CELL Xr細(xì)胞存活率分析儀每天對(duì)兩種方案進(jìn)行取樣和 計(jì)算， 以監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活率。此外， 還使用了Life Technologies的EVOS FL 細(xì)胞成像系統(tǒng)檢查120 mL Evolve袋內(nèi)的培養(yǎng)物。 圖2顯示的是以10X放大倍數(shù)拍 攝的人類(lèi)外周血全T細(xì)胞。
圖2： 使用Life Technologies的EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)在10X放大倍數(shù)下拍攝的Evolve 120 mL細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)的T細(xì)胞生長(zhǎng)情況
創(chuàng)建低溫保存T細(xì)胞庫(kù)和冷凍培養(yǎng)基配方
創(chuàng)建細(xì)胞庫(kù)對(duì)本研究而言非常重要， 因?yàn)樵谶M(jìn)行廣泛研究時(shí)， 購(gòu)買(mǎi)多瓶原代人類(lèi) T細(xì)胞會(huì)使得成本過(guò)高。 一旦發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞擴(kuò)增的最佳條件， 便選擇一包密度最高、 生存能力最強(qiáng)的Evolve袋復(fù)凍回細(xì)胞庫(kù)中。 低溫保存的培養(yǎng)基配方如表2所示。 首先，向已用培養(yǎng)基的細(xì)胞內(nèi)再添加5%的熱滅活人血清，將血清總濃度提升至 10%。然后，向該混合液內(nèi)注入新鮮培養(yǎng)基。不得使用離心機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)回 凍等離心操作， 而是將DMSO直接添加到細(xì)胞和培養(yǎng)基的混合物中。 然后， 將其 分配到1 mL的低溫保存管中。 隨后， 將低溫保存管放入BioCision CoolCell， 置 于溫度設(shè)置為-80 C的New Brunswick Innova U360 ULT冰箱內(nèi)過(guò)夜。 24小時(shí)后， 將其移入液態(tài)氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。
優(yōu)化Evolve透氣袋的培養(yǎng)條件
解凍法得到優(yōu)化后， 則針對(duì)理想的細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增能力對(duì)Evolve袋進(jìn)行進(jìn)一步評(píng) 估。 T細(xì)胞直接解凍至最大灌注量為120 mL的Evolve袋中， 工作容積為30 mL， 密度為0.5 x 106 cells/mL。 通過(guò)加入新鮮的完全培養(yǎng)基維持該密度水平， 直到工 作容積達(dá)到100 mL。 當(dāng)袋子達(dá)到100 mL工作容積后， 根據(jù)需要， 可通過(guò)取出50 mL培養(yǎng)基， 替換成新鮮的完全培養(yǎng)基， 實(shí)現(xiàn)50%的容積置換， 以維持0.5 x 106 cells/mL的密度水平。
比較搖瓶和透氣袋中的T細(xì)胞培養(yǎng)
此外， 本研究還使用了New Brunswick S41i Co2恒溫?fù)u床對(duì)不同振蕩速度下帶擋 板和不帶擋板的一次性搖瓶培養(yǎng)和透氣袋培養(yǎng)方案進(jìn)行了比較。 每個(gè)搖瓶的接種 密度都為0.5 x 106 cells/mL， 利用了250 mL搖瓶20%的工作容積。 作為對(duì)照， 也采用上述標(biāo)準(zhǔn)最佳設(shè)定值和接種密度將T細(xì)胞放置在工作容積為100 mL的120 mL Evolve細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行生長(zhǎng)。
使用不同的透氣袋評(píng)估擴(kuò)大規(guī)模的可能性
當(dāng)優(yōu)化了120 mL Evolve袋T細(xì)胞培養(yǎng)后， 便開(kāi)始嘗試擴(kuò)大規(guī)模， 首先從500 mL Evolve袋開(kāi)始。 情況與上述情況一致。
我們還對(duì)另一制造商相似容積的透氣袋的培養(yǎng)效果進(jìn)行了研究。 除了大尺寸Evolve袋， 我們還使用了Lampire Biological Laboratories OMNI C3 250 mL細(xì)胞培養(yǎng)袋。 雖然Evolve袋的最大灌注量為500 mL， 我們只使用了200 mL工作容積， 以便將其與最大工作容積相對(duì)較小的Lampire袋進(jìn)行比較。
結(jié)果與討論
優(yōu)化T細(xì)胞解凍方法和初始培養(yǎng)
我們對(duì)T細(xì)胞采取了兩種解凍方法， 一種遵守了制造商建議的靜置培養(yǎng)保持時(shí)間， 另一種則沒(méi)有（見(jiàn)材料和方法）。 每天對(duì)兩種培養(yǎng)基進(jìn)行取樣并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和存 活率。 過(guò)了初始解凍期后， 將其放入細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)一步培養(yǎng)， 細(xì)胞密度維持在0.5 106cells/mL水平， 并加入新鮮培養(yǎng)基以達(dá)到100 mL最大工作容積。 繼續(xù)采用直 接解凍至袋中的方法。 相比懸浮方瓶靜置解凍法， 該方法不僅更為方便， 峰值細(xì)胞密度也超過(guò)了前者。數(shù)據(jù)如圖3所示。
圖3： 靜置解凍法與直接解凍至袋內(nèi)比較（解凍后， 都采用為期8天的袋內(nèi)培養(yǎng)）
建立T細(xì)胞低溫保存庫(kù)
許多制造商不保證低溫保存后細(xì)胞能夠存活。 然而， 我們已經(jīng)通過(guò)自己的處理技術(shù)和培養(yǎng)基配方證明了可以將細(xì)胞保存起來(lái)， 以備將來(lái)使用（圖4）。
圖4： 將T細(xì)胞從低溫保存細(xì)胞庫(kù)取出解凍后， 在透氣袋內(nèi)培養(yǎng)生長(zhǎng)， 并進(jìn)行為期5天的監(jiān)測(cè)
比較搖瓶和透氣袋中的T細(xì)胞培養(yǎng)
搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)密度并未達(dá)到同期透氣袋培養(yǎng)的細(xì)胞密度水平。 如圖5所示。 由于搖瓶和細(xì)胞培養(yǎng)袋的工作容積不同， 圖5顯示的是50 mL灌注量獲得的細(xì)胞總 數(shù)， 以便進(jìn)行比較。 在95和100 rpm的搖瓶培養(yǎng)中也觀察到大量的細(xì)胞團(tuán)。 在70 rpm搖瓶和透氣袋培養(yǎng)中未觀察到細(xì)胞團(tuán)。 鑒于搖瓶培養(yǎng)表現(xiàn)不佳， 我們放棄了搖瓶 法， 將重點(diǎn)放在透氣袋培養(yǎng)上， 并利用更大尺寸的透氣袋進(jìn)一步探索擴(kuò)大規(guī)模的可能。
使用不同的透氣袋評(píng)估擴(kuò)大規(guī)模的可能性
為了確定Evolve袋是否是擴(kuò)大生物反應(yīng)器接種T細(xì)胞規(guī)模的理想方法， 本研究測(cè)試了另一制造商的細(xì)胞培養(yǎng)袋。 每天對(duì)每個(gè)袋子進(jìn)行取樣， 連續(xù)7天。 結(jié)果如圖6所示， 200 mL工作容積的Lampire袋的密度大于較大尺寸的Evolve袋。 雖然峰值密度低于120 mL的Evolve袋， 但Lampire袋的總細(xì)胞數(shù)量比較大尺寸的Evolve袋高出了2.5 倍 （未顯示數(shù)據(jù)）。 我們還測(cè)試了1 L到5 L的更大尺寸的透氣袋， 但在最初的評(píng)估中未能成功實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞擴(kuò)增。
圖5： 在塑料搖瓶中以不同振蕩速度培養(yǎng)的T細(xì)胞相比透氣袋培養(yǎng)的效果
圖6： 比較較大尺寸的Evolve透氣袋和Lampire透氣袋在人類(lèi)T細(xì)胞擴(kuò)增方面的表現(xiàn)
結(jié)論
通過(guò)本研究， 成功地建立了細(xì)胞庫(kù)以便進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 在Evolve透氣袋中， T細(xì)胞擴(kuò)增明顯。 采用120 mL Evolve透氣袋時(shí)， New Brunswick S41i CO2恒溫?fù)u床 的振蕩平臺(tái)共可容納10包Evolve袋。 如果10個(gè)Evolve袋的灌注量都為100 mL， 且密度均達(dá)到3.91 x 108個(gè)細(xì)胞/袋（圖3）， 則1 L液體就可以達(dá)到3.91 x 109個(gè)T細(xì)胞存 活總量。在該密度條件下， BioBLU 3c一次性罐在3.75 L最大工作容積時(shí)，可接種大約255 mL的細(xì)胞數(shù)量。 利用S41i恒溫?fù)u床擴(kuò)增的單批T細(xì)胞， 可實(shí)現(xiàn)1 L細(xì)胞接種 4臺(tái)達(dá)到最大工作容積(3.75 L) 的BioBLU 3c一次性罐。
對(duì)Lampire透氣袋的初步研究也顯示了可以擴(kuò)大規(guī)模的潛力。 Lampire袋的最大工作容積為250 mL。 本研究中， 其工作容積為200 mL。 S41i Co2恒溫?fù)u床2恒溫?fù)u床 的振蕩平臺(tái)最多可容納6包Lampire袋， 可以將細(xì)胞總?cè)萘繑U(kuò)大至1.2 L。
本研究表明， 透氣袋搭配S41i Co2恒溫?fù)u床可實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的快速初始擴(kuò)增， 其能夠產(chǎn)生足量的細(xì)胞接種多個(gè)臺(tái)式生物反應(yīng)器。
參考文獻(xiàn)
[1] Khandaker Siddiquee和Ma Sha。 Microcarrier-based Expansion of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Shake Flasks.Bioprocessing Journal, Volume 12, Issue 4, Winter 2013.
