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當(dāng)今，對細(xì)胞內(nèi)表達(dá)物的監(jiān)控對于研究細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老以及細(xì)胞病變、藥物代謝等領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。本文將對常用的幾種活細(xì)胞提取技術(shù)進(jìn)行概括
為什么要進(jìn)行活細(xì)胞提??？
在傳統(tǒng)的細(xì)胞提取技術(shù)中往往使用化學(xué)、生物學(xué)方法將細(xì)胞裂解，使細(xì)胞內(nèi)容物滲出從而達(dá)到提取目的。但這類方法必須破壞細(xì)胞本身，在進(jìn)行時(shí)效研究中，往往要將細(xì)胞分組分時(shí)處理，這類方法始終無法克服由于細(xì)胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,2]
全新的活細(xì)胞提取技術(shù)解決了這一問題。這種技術(shù)使用微型注射器能夠從細(xì)胞的特定部位每次僅提取極少量的胞質(zhì)或者胞核（pL級），從而保證細(xì)胞活力的同時(shí)獲得足夠分析的細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)對同一細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)變化的監(jiān)測，克服傳統(tǒng)法中由于細(xì)胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,3]
活細(xì)胞提取的4種常用技術(shù) 1. 納米拖網(wǎng) 這項(xiàng)技術(shù)由Cao等人[2-5]的實(shí)驗(yàn)室建立。在他們的實(shí)驗(yàn)中，他們將150 nm直徑氧化鋁管制成納米拖網(wǎng)。隨后將細(xì)胞種植在這種拖網(wǎng)表面。通過這些管道能夠?qū)①N在表面的細(xì)胞膜刺破，從而讓細(xì)胞內(nèi)容物滲入到下層的提取緩沖液中，這一方法能夠使約7%內(nèi)容物滲透入緩沖液中。他們指出這種方法得到的提取液能夠用于熒光蛋白、酶測定以及PCR等試驗(yàn)。在他們研究中發(fā)現(xiàn)使用這種納米拖網(wǎng)對iPSc誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的中mRNA的提取分析實(shí)驗(yàn)中。他們成功分析出44個(gè)mRNA序列，而用傳統(tǒng)裂解方法僅能夠分析出7個(gè)。 2. 細(xì)胞微注射玻璃針
細(xì)胞微注射玻璃針主要用于對大細(xì)胞進(jìn)行注射。這種方法主要是用0.5~5 m的玻璃管直接從細(xì)胞內(nèi)抽取內(nèi)容物。然而這種方法往往會造成細(xì)胞損傷，因此目前也有實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出100 nm的注射針進(jìn)行提取。[4,6,7]Actis等[4]使用離子電導(dǎo)顯微鏡結(jié)合微注射玻璃針建立了fL級細(xì)胞內(nèi)容物提取方法。在這種方法中他們使用一種含有有機(jī)相的微注射玻璃針，通過壓力來移動(dòng)有機(jī)相從而實(shí)現(xiàn)提取。他們所建立的方法能夠僅提取HeLa細(xì)胞內(nèi)的RNA、線粒體DNA表達(dá)物而不提取任何細(xì)胞器。
3. FluidFM
流體力顯微鏡使用中空的原子力探針，通過力學(xué)探測精準(zhǔn)可控的刺穿細(xì)胞膜。隨后通過對尖端施加負(fù)壓從而提取細(xì)胞。Guillaume-Gentil等報(bào)告指出，使用這項(xiàng)技術(shù)提取高達(dá)90%的細(xì)胞胞質(zhì)的極端條件下，細(xì)胞在5天內(nèi)仍保持較高活力。另外他們還使用該技術(shù)同時(shí)對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行提取并進(jìn)行酶測定和PCR實(shí)驗(yàn)取得成功。[1,8]
4. 碳納米管
碳納米管目前主要應(yīng)用于低損傷細(xì)胞監(jiān)控中。Singhal等人將50 m長的多壁碳納米管的末端與微孔玻璃管相連，從而提取胞漿中熒光標(biāo)記的Ca離子。但是目前該方法提取的體積很小，其應(yīng)用仍然受到限制。[5]
總結(jié)：
盡管當(dāng)下有許多其他方法可以評估細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，包括熒光標(biāo)記、量子點(diǎn)、納米粒子， FRET，熱敏熒光標(biāo)記抗體或RNA。這些方法能夠提供高特異性、高對比度和高分辨率，但是都只能識別少量預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)，無法全面監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化。同時(shí)外源材料的引入也存在著對細(xì)胞活力產(chǎn)生不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。[3]
相比之下，細(xì)胞活體提取技術(shù)有著這些方法無法比擬的優(yōu)勢。這種技術(shù)能夠在全面的監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化的同時(shí)，還能夠盡可能的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本文所介紹的4種技術(shù)也有各自的優(yōu)缺點(diǎn)：納米拖網(wǎng)能夠提供較大的細(xì)胞提取量，但是無法選擇所需提取的細(xì)胞，并且對于不同細(xì)胞的提取量差異較大。而細(xì)胞微注射玻璃針操作復(fù)雜，所需使用的玻璃針會直接影響注射品質(zhì)。FluidFM技術(shù)使用方便，能夠準(zhǔn)確定位，但該項(xiàng)技術(shù)較新，目前使用人數(shù)不多。碳納米管目前仍受制于其提取量的制約，仍有待發(fā)展。[9-10]
參考文獻(xiàn)
[1] O. Guillaume-Gentil et al., Cell 166, 506 (2016).
[2] Y. Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1866 (2017).
[3] J. Liu, J. Wen, Z. Zhang, H. Liu, Y. Sun, Microsys. Nanoeng. 1,15020 (2015).
[4] P. Actis et al., ACS Nano 8, 546 (2014).
[5] R. Singhal et al., Nat. Nanotechnol. 6, 57 (2011).
[6] W. Kang, R. L. McNaughton, H. D. Espinosa, Trends Biotechnol. 34, 665 (2016).
[7] Y. Nashimoto et al., ACS Nano 10, 6915 (2016).
[8] A. Meister et al., Nano Lett. 9, 2501 (2009).
[9] C. Chiappini et al., Nat. Mater. 14, 532 (2015).
[10] A. M. Xu et al., Nat. Commun. 5, 8 (2014).
在傳統(tǒng)的細(xì)胞提取技術(shù)中往往使用化學(xué)、生物學(xué)方法將細(xì)胞裂解，使細(xì)胞內(nèi)容物滲出從而達(dá)到提取目的。但這類方法必須破壞細(xì)胞本身，在進(jìn)行時(shí)效研究中，往往要將細(xì)胞分組分時(shí)處理，這類方法始終無法克服由于細(xì)胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,2]
全新的活細(xì)胞提取技術(shù)解決了這一問題。這種技術(shù)使用微型注射器能夠從細(xì)胞的特定部位每次僅提取極少量的胞質(zhì)或者胞核（pL級），從而保證細(xì)胞活力的同時(shí)獲得足夠分析的細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)對同一細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)變化的監(jiān)測，克服傳統(tǒng)法中由于細(xì)胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,3]
活細(xì)胞提取的4種常用技術(shù) 1. 納米拖網(wǎng) 這項(xiàng)技術(shù)由Cao等人[2-5]的實(shí)驗(yàn)室建立。在他們的實(shí)驗(yàn)中，他們將150 nm直徑氧化鋁管制成納米拖網(wǎng)。隨后將細(xì)胞種植在這種拖網(wǎng)表面。通過這些管道能夠?qū)①N在表面的細(xì)胞膜刺破，從而讓細(xì)胞內(nèi)容物滲入到下層的提取緩沖液中，這一方法能夠使約7%內(nèi)容物滲透入緩沖液中。他們指出這種方法得到的提取液能夠用于熒光蛋白、酶測定以及PCR等試驗(yàn)。在他們研究中發(fā)現(xiàn)使用這種納米拖網(wǎng)對iPSc誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的中mRNA的提取分析實(shí)驗(yàn)中。他們成功分析出44個(gè)mRNA序列，而用傳統(tǒng)裂解方法僅能夠分析出7個(gè)。 2. 細(xì)胞微注射玻璃針
細(xì)胞微注射玻璃針主要用于對大細(xì)胞進(jìn)行注射。這種方法主要是用0.5~5 m的玻璃管直接從細(xì)胞內(nèi)抽取內(nèi)容物。然而這種方法往往會造成細(xì)胞損傷，因此目前也有實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出100 nm的注射針進(jìn)行提取。[4,6,7]Actis等[4]使用離子電導(dǎo)顯微鏡結(jié)合微注射玻璃針建立了fL級細(xì)胞內(nèi)容物提取方法。在這種方法中他們使用一種含有有機(jī)相的微注射玻璃針，通過壓力來移動(dòng)有機(jī)相從而實(shí)現(xiàn)提取。他們所建立的方法能夠僅提取HeLa細(xì)胞內(nèi)的RNA、線粒體DNA表達(dá)物而不提取任何細(xì)胞器。
3. FluidFM
流體力顯微鏡使用中空的原子力探針，通過力學(xué)探測精準(zhǔn)可控的刺穿細(xì)胞膜。隨后通過對尖端施加負(fù)壓從而提取細(xì)胞。Guillaume-Gentil等報(bào)告指出，使用這項(xiàng)技術(shù)提取高達(dá)90%的細(xì)胞胞質(zhì)的極端條件下，細(xì)胞在5天內(nèi)仍保持較高活力。另外他們還使用該技術(shù)同時(shí)對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行提取并進(jìn)行酶測定和PCR實(shí)驗(yàn)取得成功。[1,8]
4. 碳納米管
碳納米管目前主要應(yīng)用于低損傷細(xì)胞監(jiān)控中。Singhal等人將50 m長的多壁碳納米管的末端與微孔玻璃管相連，從而提取胞漿中熒光標(biāo)記的Ca離子。但是目前該方法提取的體積很小，其應(yīng)用仍然受到限制。[5]
總結(jié)：
盡管當(dāng)下有許多其他方法可以評估細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，包括熒光標(biāo)記、量子點(diǎn)、納米粒子， FRET，熱敏熒光標(biāo)記抗體或RNA。這些方法能夠提供高特異性、高對比度和高分辨率，但是都只能識別少量預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)，無法全面監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化。同時(shí)外源材料的引入也存在著對細(xì)胞活力產(chǎn)生不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。[3]
相比之下，細(xì)胞活體提取技術(shù)有著這些方法無法比擬的優(yōu)勢。這種技術(shù)能夠在全面的監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化的同時(shí)，還能夠盡可能的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本文所介紹的4種技術(shù)也有各自的優(yōu)缺點(diǎn)：納米拖網(wǎng)能夠提供較大的細(xì)胞提取量，但是無法選擇所需提取的細(xì)胞，并且對于不同細(xì)胞的提取量差異較大。而細(xì)胞微注射玻璃針操作復(fù)雜，所需使用的玻璃針會直接影響注射品質(zhì)。FluidFM技術(shù)使用方便，能夠準(zhǔn)確定位，但該項(xiàng)技術(shù)較新，目前使用人數(shù)不多。碳納米管目前仍受制于其提取量的制約，仍有待發(fā)展。[9-10]
參考文獻(xiàn)
[1] O. Guillaume-Gentil et al., Cell 166, 506 (2016).
[2] Y. Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1866 (2017).
[3] J. Liu, J. Wen, Z. Zhang, H. Liu, Y. Sun, Microsys. Nanoeng. 1,15020 (2015).
[4] P. Actis et al., ACS Nano 8, 546 (2014).
[5] R. Singhal et al., Nat. Nanotechnol. 6, 57 (2011).
[6] W. Kang, R. L. McNaughton, H. D. Espinosa, Trends Biotechnol. 34, 665 (2016).
[7] Y. Nashimoto et al., ACS Nano 10, 6915 (2016).
[8] A. Meister et al., Nano Lett. 9, 2501 (2009).
[9] C. Chiappini et al., Nat. Mater. 14, 532 (2015).
[10] A. M. Xu et al., Nat. Commun. 5, 8 (2014).
