核酸酶通過減切核酸骨架中的磷酸二酯鍵來降解 DNA 和 RNA。 雖然有些核酸酶是有用的研究工具，但是通?？茖W家需要完整的 生物樣品信息用于 PCR，克隆，測序或基因編輯等應用。因此， 研究核酸的科學家需要不含核酸酶的試劑和容器。水作為緩沖液 和試劑的主要成分，也應該不含有核酸酶?？墒?，核酸酶在實驗室中普遍存在，它們普遍存在于塑料制品和試劑中，甚至可能來自 科學家自己(皮膚，唾液等)1，它們非常穩(wěn)定，難以滅活 2; 因此，經常使用 DEPC 處理來消除它們。 而超濾可以作為 DEPC 的 替代方案生產無核酸酶水，處理方法方便和安全。 結果和討論 在分子生物學中，使用核酸酶污染的試劑，特別是水可能導致結果的不一致性，甚至會損失有價值的樣品。DEPC 是一種有效的非 特異性 RNA 酶抑制劑，用于 RNase 滅活，且使用了多年 3。用 DEPC 對溶液進行化學處理是一種非常有效的方法，但它存在幾 個缺點： ? 安全問題。DEPC 是一種疑似致癌物質，因為它可能與嘌呤發(fā)生反應，因此需要謹慎使用。此外，如果瓶子在室溫中暴露于濕潤 的空氣中，DEPC 可能會水解，將會產生二氧化碳，這會增加潛在的危險。 ? 時間和能源消耗。DEPC 和核酸酶之間的化學反應需要一定的時間，為了破壞 DEPC，需要對溶液高壓滅菌。而高壓滅菌需要消 耗大量的水和電。 ? 引入可能影響實驗的雜質。 當 DEPC 在高壓滅菌時會水解產生乙醇和二氧化碳(圖 1)。 乙醇可能與后續(xù)的實驗步驟中的雜質 反應，有可能產生不需要的副產物。 此外，DEPC 對腺苷有很強的親和力，即使只有痕量的 DEPC 保留在溶液中，它們也可能 與腺苷核苷酸發(fā)生反應(印跡，PCR 反應等)而導致實驗結果不準確 1 ，痕量 DEPC 也可能與胺基和硫醇反應。 ? 核酸酶不能從水中直接除去，而只能通過與 DEPC 的化學反應而失活。 Figure 1. Degradation of DEPC releases contaminants into water. 經過測試超濾可以作為產生無核酸酶水的替代方法。 這個過程使用中空纖維根據其孔徑分離污染物。一次性濾頭內含 13 000 Da 標稱分子量(NMWL)的聚砜超濾纖維(圖 2)。 Scale (100 μm) Figure 2. Polysulfone hollow fiber used for ultrafiltration in the Biopak? cartridge. 圖3 顯示當使用超濾過濾RNA 酶溶液時，rRNA 保持了完整。同時，使用常規(guī)DEPC 處理RNase 溶液也能防止rRNA 降解。作為對比， 當 RNase 溶液未處理時，rRNA 被降解。 這表明了使用超濾去除核糖核酸 RNA 酶與通過 DEPC 處理滅活 RNase 效果相當。 Figure 3. Gel electrophoresis of rRNA in water previously spiked with RNase and either DEPC-treated, ultrafiltered, or left untreated. 實驗部分 用超純水溶解 RNase A 并分成三份。方案是： (1)用 DEPC 處理并高壓滅菌 ; (2)通過 Biopak 超濾終端進行處理 ; (3)未處理。 將核糖體 RNA 加入到每個溶液中，孵育 20 分鐘，然后用瓊脂糖凝膠進行變性條件下的電泳。 許多分子生物學應用都需要無核酸酶的水。與耗時又麻煩的 DEPC 處理方法不同，通過水純化系統(tǒng)的超濾終端方式獲得無核酸酶 的水，是一種安全又便捷的方法。 這種方法對科研有很多好處： ? 按需，方便。當需要時，可以非常容易地生產新鮮純化的無核酸酶的水。沒有必要提前訂購瓶裝無核酸酶的水，或花時間制備 DEPC 水。 ? 沒有風險。不需要化學品操作。另外，由于沒有添加化學物質到水中，所以沒有其他試劑干擾的風險。 ? 高純度無核酸酶的水。超濾技術是從水中直接除去核酸酶而不是僅僅使他們滅活。因為過濾終端被設計成直接連接到水純化系統(tǒng) 的出口，例如 Milli-Q?，因此可以非常方便的獲得無核酸酶的超純水。 References 1. R.E. Farrell, Jr., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, Elsevier Acad. Press, (2005), 47-56. 2. B. L. Pasloske, Ribonuclease Inhibitors, Methods in Molecular Biology, vol. 160: Nuclease Methods and Protocols, 105-111. 3. B. Wolf, J. A. Lesnaw, M. E. Reichmann, A Mechanism of the Irreversible Inactivation of Bovine Pancreatic Ribonuclease by Diethylpyrocarbonate, European Journal of Biochemistry (1970). 13 (3): 519–25. 4. Diethyl pyrocarbonate – Product information sheet; https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_ Information_Sheet/d5758pis.pdf 5. S. Mabic and I. Kano, Impact of Purified Water Quality on Molecular Biology Experiments, Clin Chem Lab Med, (2003), 41(4):486–491.
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