所以，小編梳理了一下在抗病毒藥物、疫苗研發(fā)生產(chǎn)等相關(guān)領(lǐng)域的工作中，我們的微孔板檢測(cè)及成像設(shè)備能夠開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)和項(xiàng)目，希望能夠?qū)υ诠?jiān)崗位上奮斗的老師們有所幫助。

病毒，可以是惡魔，也可以是工具
我們都知道，病毒（virus)由一種核酸分子（dna或rna）與蛋白質(zhì)（protein）構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成（如朊病毒）的有機(jī)形態(tài)，它介于生命與非生命之間，超然在五界之外（傳統(tǒng)的五界分類法）。
這樣一種看起來(lái)無(wú)比“簡(jiǎn)單而低級(jí)”的東西，卻在人類歷史上留下持續(xù)至今揮之不去的陰影，比如ebola，比如hiv，比如，現(xiàn)在全國(guó)上下一心對(duì)抗的新冠病毒。但是，擁有高級(jí)智慧的人類，怎會(huì)輕易被這些簡(jiǎn)單而低級(jí)的玩意兒打?。克?，我們有了疫苗，有了抗病毒藥物，聰明的人類還利用病毒感染宿主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制的機(jī)制，把惡魔變成工具，應(yīng)用到人類的生產(chǎn)生活中，比如通過(guò)病毒進(jìn)行花卉育種，利用病毒作為載體進(jìn)行生物研究、基因治療等等。所以今天，我們首先分享一些圍繞抗病毒藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)等相關(guān)領(lǐng)域，微孔板檢測(cè)和成像設(shè)備的應(yīng)用方向，后續(xù)我們會(huì)為大家繼續(xù)分享微孔板相關(guān)設(shè)備在如何“利用”病毒開(kāi)展生物研究工作。

病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定
病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，除了通過(guò)rt-pcr的方法，可以通過(guò)細(xì)胞病變效應(yīng)、紅細(xì)胞吸附和免疫標(biāo)記檢查法等評(píng)價(jià)病毒在細(xì)胞中的增殖情況。細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, cpe），是指病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起的光鏡下可見(jiàn)的細(xì)胞病理改變。大多數(shù)動(dòng)物病毒感染敏感細(xì)胞培養(yǎng)都能引起其顯微表現(xiàn)改變，例如細(xì)胞聚集成團(tuán)腫大圓縮脫落及細(xì)胞融合成為多核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體（inclusion body），乃至細(xì)胞裂解等，正是因?yàn)閏pe的表現(xiàn)，我們可以在體外細(xì)胞水平評(píng)價(jià)病毒感染宿主細(xì)胞的情況。病毒毒價(jià)測(cè)定是病毒學(xué)相關(guān)研究中最基本的技術(shù)手段，無(wú)論疫苗研發(fā)、抗病毒藥物評(píng)估或者是病毒重組載體構(gòu)建，均需要在不同環(huán)節(jié)評(píng)定病毒毒價(jià)，而目前主要方法包括蝕斑實(shí)驗(yàn)、tcid50測(cè)定和免疫染色法等。

病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)
病毒蝕斑是一種檢查和準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法。方法：將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見(jiàn)的蝕斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位 (plaque forming ?unit,pfu)。通常以每毫升病毒液的空斑形成單位既 pfu/ml表示。



上圖來(lái)自武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，病毒感染6孔板細(xì)胞后形成空斑病灶，使用中性紅染色后，通過(guò)cytation的4x物鏡明場(chǎng)模式對(duì)全孔進(jìn)行拼接成像，軟件分析識(shí)別孔中的空斑病灶個(gè)數(shù)。

tcid50法
tcid50法是測(cè)定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生感染的最小量。方法：一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察cpe、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞的量為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法（reed muench法）計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量（ 50%tissue culture ?infectious ?dose,tcid50)。

免疫染色法
空斑實(shí)驗(yàn)法或常規(guī)tcid50測(cè)定滴度依賴于病毒在感染細(xì)胞中的復(fù)制以及感染周邊細(xì)胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細(xì)胞并表達(dá)病毒所編碼的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or ifu/ml）測(cè)定病毒滴度需要的時(shí)間比空斑法（pfu/ml）更短。其中，免疫染色法包括hrp組化或免疫熒光染色等。同樣類型方法也適用于表達(dá)熒光報(bào)告基因的重組病毒的毒價(jià)測(cè)定。例如，以針對(duì)桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體標(biāo)記被病毒感染的細(xì)胞，然后以hrp-標(biāo)記的二抗與感染細(xì)胞進(jìn)行染色。通過(guò)底物顯色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)感染斑點(diǎn)的數(shù)量，經(jīng)過(guò)稀釋倍數(shù)的換算，即可得出病毒的滴度（ifu/ml）。

輸

問(wèn)題：無(wú)論是plaque assays還是tcid50，均涉及較多微孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)或陰/陽(yáng)性孔判斷，常規(guī)的顯微鏡觀測(cè)法，操作不便且對(duì)研究者傷害較大。因此biotek為大家提供了更加自動(dòng)化的解決方法：通過(guò)cytation/lionheartfx自動(dòng)化成像設(shè)備進(jìn)行cpe或者plaque的成像及計(jì)數(shù)。

上圖：cytation5自動(dòng)化成像系統(tǒng)支持明場(chǎng)、彩色明場(chǎng)、熒光場(chǎng)等模式自動(dòng)化成像檢測(cè)，并且可選擇大視野成像模式，4倍鏡一個(gè)視野可覆蓋384孔板整孔，提高全孔、整板成像的檢測(cè)速度。




上圖：兩種病毒感染細(xì)胞后，通過(guò)紅色/綠色熒光探針標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，采用cytation雙熒光通道自動(dòng)成像，并對(duì)病毒感染的細(xì)胞病灶進(jìn)行識(shí)別成像。



上圖：對(duì)24孔板進(jìn)行自動(dòng)成像，并且定量分析每孔內(nèi)的病灶個(gè)數(shù)。無(wú)論是cytation系列還是lionheart系列，均能對(duì)6-384孔板進(jìn)行多通道整孔成像，極大減少了人工識(shí)別cpe及plaque的工作。

疫苗研發(fā)生產(chǎn)中的應(yīng)用

疫苗效力評(píng)價(jià)最有效的方法是中和抗體水平檢測(cè)及中和抗體活力評(píng)價(jià)。

普通病毒疫苗效果的評(píng)價(jià)，可以通過(guò)收集減毒或滅活病毒疫苗免疫后人或動(dòng)物血清，與自然源性病毒進(jìn)行中和抑制試驗(yàn)，以檢測(cè)中和抗體效價(jià)及中和抗體活力。

中和抗體的原理是抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性結(jié)合，使病毒喪失感染細(xì)胞的能力，一般采用的是固定病毒—稀釋血清法。

固定病毒—稀釋血清法

將不同稀釋度的血清與固定量的病毒（200tcid50、eid50或ld50）混合，一般37°條件下感作一定時(shí)間以后（通常為1h），再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，每一稀釋度接種3～6只（個(gè)、管）試驗(yàn)動(dòng)物(或雞胚、細(xì)胞)，記錄每組樣品的動(dòng)物死亡數(shù)、累積死亡數(shù)和累積存活數(shù)，按此前提到的reed-muench法或karber法計(jì)算其半數(shù)保護(hù)量（pd50），即該血清的50%中和效價(jià)(pd50)。

可見(jiàn)，對(duì)于抗病毒疫苗中和抗體的測(cè)定方法中，最終的檢測(cè)指標(biāo)也可以用cpe計(jì)數(shù)、或熒光標(biāo)記的病毒灶來(lái)評(píng)估，而完整的中和抗體檢測(cè)需要測(cè)定大量的細(xì)胞樣本，通常要對(duì)整板96孔板的整孔進(jìn)行觀測(cè)。這樣的應(yīng)用中，biotek能夠建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案流程，樣品的拍攝、病灶的分析計(jì)數(shù)到結(jié)果的輸出可以自動(dòng)完成：

上圖：cytation對(duì)96孔板內(nèi)的熒光標(biāo)記的病毒灶進(jìn)行全孔、整板成像。




上圖：通過(guò)圖像分析評(píng)價(jià)不同濃度的免疫血清抑制病毒感染細(xì)胞的能力，pos表示該孔內(nèi)有病毒病灶形成，neo表示改孔無(wú)病灶。根據(jù)此結(jié)果，后續(xù)可計(jì)算pd50。

抗病毒藥物篩選相關(guān)應(yīng)用

針對(duì)不同種類的病毒，科學(xué)家們的前期工作已經(jīng)積累了較多的篩選策略，比如，對(duì)于目前來(lái)勢(shì)洶洶的冠狀病毒，在抗擊sars及mers的經(jīng)驗(yàn)中對(duì)于此類cov新藥的主要靶點(diǎn)可以圍繞cov表面結(jié)構(gòu)的棘突糖蛋白、靶向宿主受體的單克隆抗體、進(jìn)入途徑有關(guān)的宿主蛋白酶抑制劑、以cov復(fù)制結(jié)構(gòu)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的sirnas等（zumla a, nature reviews drug discovery, 2016, 15(5): 327.。

對(duì)于hiv等逆轉(zhuǎn)錄病毒，研發(fā)策略可傾向于受體拮抗劑、整合酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑這些方向；對(duì)于hcv病毒可采用rna復(fù)制酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等（nature reviews drug discovery 6, 1001-1018）。

基于微孔板的高通量及高內(nèi)涵篩選平臺(tái)為以上策略提供了靈活的解決方案，比如下面這篇文章，可以為大家提供一些基于微孔板篩選抗病毒藥物的思路，

文中選擇的靶點(diǎn)是ns3解旋酶，hcv解旋酶是一種蛋白酶，位于病毒多功能非結(jié)構(gòu)蛋白3 (ns3)的c端三分之二。因此，抑制解旋酶可作為抗生素或抗病毒藥物。

構(gòu)建hcv ns3h（ns3 lacking the protease domain），使用dna寡核苷酸序列代替rna序列，通過(guò)fp、htrf和alphascreen篩選能夠抑制ns3-dna復(fù)合體形成的化合物。這是一種比較新穎的思路，采用抑制dna復(fù)合物的方法來(lái)篩選hcv解旋酶抑制劑。所用的化合物庫(kù)來(lái)自sigma’s library of pharmacologically active compounds (lopac)。

上圖展示了基于熒光偏振的篩選思路以及得到的4個(gè)候選化合物劑量效應(yīng)曲線。

文章展示了使用多功能微孔板檢測(cè)設(shè)備在篩選hcv抗病毒藥物的有效性，并且表明其采用的這三種方法均是較為成熟的商品化方案，篇幅所限，感興趣的老師可以在原文中閱讀其他方法的篩選結(jié)果和思路。

biotek為大家提供的synergyneo2是頂尖的微孔板藥物篩選平臺(tái)，能夠快速高效的實(shí)現(xiàn)以上的熒光分子互作的篩選技術(shù)平臺(tái)。

上圖：synergyneo2高通量微孔板檢測(cè)儀能夠提供高速、高效的trf、fp、htrf、alphascreen技術(shù)檢測(cè)平臺(tái)。除了采用分子互作技術(shù)針對(duì)性的開(kāi)展基于靶點(diǎn)的篩選，也可以采用基于表型的方法，例如cpe病灶改變、細(xì)胞活力等進(jìn)行快速化合物篩選，這里就不一一贅述了。

病毒的臨床診斷

病毒臨床診斷方面的應(yīng)用主要集中在免疫學(xué)檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定患者血液樣本中的病毒抗體或表面抗原的含量判斷是否存在病毒感染。比如hbv表面抗原（hbsag）是病毒外膜的主要組成蛋白，一直是hbv感染最重要的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，也是最直接的病原學(xué)證據(jù)之一。目前針對(duì)hbv, hcv, hiv等多種病毒均有臨床可用的商品化解決方案，除了常見(jiàn)的吸收光elisa測(cè)定，也有諸多試劑開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)研發(fā)了靈敏度更高，檢測(cè)更為便捷的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)法，即trfia技術(shù)。

輸

值得一提的是，當(dāng)下新冠狀病毒2019-ncov的臨床診斷雖然主要依賴核酸檢測(cè)，但是由于核酸檢測(cè)的取樣位置、患者的免疫狀態(tài)等原因，單純依靠熒光定量pcr的核酸檢測(cè)有一定的局限性。目前，已經(jīng)有試劑公司開(kāi)發(fā)出針對(duì)新冠狀病毒的igm和igg抗體檢測(cè)elisa試劑盒，能夠?yàn)榕R床提供血清學(xué)診斷輔助證據(jù)，可聯(lián)合核酸檢測(cè)方法進(jìn)行使用。

biotek的synergyh1多功能微孔板檢測(cè)儀擁有中華人民共和國(guó)醫(yī)療器械注冊(cè)證，能夠?yàn)橐痪€臨床診斷崗位的醫(yī)療工作者提供精準(zhǔn)的基于吸收光、熒光、發(fā)光、時(shí)間分辨熒光及熒光偏振的免疫檢測(cè)結(jié)果。

上圖：synergyh1多功能微孔板檢測(cè)儀，能夠支持elisa、trfia、lia等多種模式的免疫檢測(cè)。

在這場(chǎng)人類和病毒曠日持久的戰(zhàn)“疫”中，相信會(huì)有越來(lái)越多的檢測(cè)手段迅速發(fā)現(xiàn)病毒，也會(huì)有更新的，更具針對(duì)性的藥物和治療方案也會(huì)相繼出現(xiàn)，我們能做的，就是堅(jiān)守好自己的崗位，持續(xù)為大家提供堅(jiān)實(shí)的硬件和技術(shù)保障。心系武漢湖北加油!

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