基于EVAGREEN?方法的CRYSTAL數(shù)字PCR絕對定量檢測

EvaGreen?是一種無致突變性、無細(xì)胞毒性的DNA結(jié)合染料，NaicaTM?Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)可兼容EvaGreen?染料進(jìn)行的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)分析。?

反應(yīng)體系中游離的的EvaGreen?染料不發(fā)出熒光信號，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光。NaicaTM?Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)使用檢測參比熒光（熒光素鈉鹽）相同的濾光片可進(jìn)行EvaGreen?染料熒光信號的檢測。?

使用NaicaTM?Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)，EvaGreen?可以通過使用簡單的引物來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)絕對定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen?的方法可檢測低至0.2copies/μL。

圖1：基于EvaGreen?染料方法的基因組DNA絕對定量

對未進(jìn)行片段化的人基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋，濃度范圍從1000-0.2copies/μL，使用NaicaTM?Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對定量，使用1.5XEvaGreen?，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重復(fù)性和穩(wěn)定性我們進(jìn)行了三次重復(fù)（R2= 0.9977）。在NTC（無模板對照）孔中沒有觀察到陽性微滴。

EVAGREEN?核酸絕對定量實(shí)驗(yàn)的建立

當(dāng)使用EvaGreen?方法進(jìn)行數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意，加入PCR?mix的模板dsDNA濃度過高將導(dǎo)致較高的背景熒光。此外，EvaGreen?染料與dsDNA具有較高的親和力，但同時(shí)也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力，導(dǎo)致背景熒光的增加。?

根據(jù)您所需定量的DNA類型和數(shù)字PCR反應(yīng)體系，需要預(yù)估實(shí)際的動(dòng)態(tài)范圍。

圖2：EvaGreen?絕對定量散點(diǎn)圖

對未片段化的人類的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋后，濃度范圍1000-0.2copies/μL，使用NaicaTM?Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對定量，使用1.5XEvaGreen?，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。

灰色點(diǎn)：陰性微滴，藍(lán)色點(diǎn)：陽性微滴。

RFU：相對熒光強(qiáng)度。

[來源：北京深藍(lán)云生物科技有限公司] PCR數(shù)字PCR芯片微滴digitalPCR