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新冠肺炎核酸檢測假陰性,癥結(jié)在這里

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2020-02-14  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):893
核心提示:全國疫情地圖最近幾天,備受民眾和媒體關(guān)心的問題之一就是新冠肺炎的病毒核酸檢測假陰性。的確,就目前的數(shù)據(jù)來看,疑似病例的病毒核酸檢測假陰性頗高,對于真是新冠病毒感染的病人,陽性率也只有30%-50%。因此很多人認(rèn)為核酸檢測不靠譜,也有醫(yī)生提出建議以CT影像學(xué)檢查陽性代替病毒核酸檢測陽性來確診。但是目前病毒核酸檢測仍然是確診標(biāo)準(zhǔn),這是為什么呢?在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(第五版)》中關(guān)于鑒別診斷是這樣描述的:“主要與流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠狀病毒等其

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全國疫情地圖

最近幾天,備受民眾和媒體關(guān)心的問題之一就是新冠肺炎的病毒核酸檢測假陰性。

的確,就目前的數(shù)據(jù)來看,疑似病例的病毒核酸檢測假陰性頗高,對于真是新冠病毒感染的病人,陽性率也只有30%-50%。因此很多人認(rèn)為核酸檢測不靠譜,也有醫(yī)生提出建議以CT影像學(xué)檢查陽性代替病毒核酸檢測陽性來確診。但是目前病毒核酸檢測仍然是確診標(biāo)準(zhǔn),這是為什么呢?

 在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(第五版)》中關(guān)于鑒別診斷是這樣描述的:

“主要與流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠狀病毒等其他已知病毒性肺炎鑒別,與肺炎支原體、衣原體肺炎及細(xì)菌性肺炎等鑒別。此外,還要與非感染性疾病,如血管炎、皮肌炎和機化性肺炎等鑒別?!?/p>

由此可見,僅憑借CT影像學(xué)檢查不能將新冠肺炎與以上病癥有效鑒別,會存在誤診的情況,而誤診又會導(dǎo)致新的交叉感染。因此,核酸檢測目前仍然是最準(zhǔn)確的診斷方法。

 那么到底是什么原因?qū)е潞怂釞z測結(jié)果假陰性如此之高?尋找問題的方向是否正確?現(xiàn)行解決辦法是否有效?

 關(guān)于這些問題,網(wǎng)絡(luò)上充斥著各種聲音。

 在發(fā)表我們的見解之前,我們先來簡單回顧一下樣本送檢流程:醫(yī)護(hù)人員采樣——包裝——運輸至檢測實驗室——樣本滅活——裂解——核酸提取——qPCR檢測——出報告。

 我們把這個流程劃分為三個環(huán)節(jié):采樣及運輸環(huán)節(jié)、核酸提取環(huán)節(jié)和qPCR檢測環(huán)節(jié)。

任何一個環(huán)節(jié)存在一點問題,都會提高假陰性風(fēng)險?,F(xiàn)在我們分別來看每個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生假陰性的主要因素。

1、采樣及運輸環(huán)節(jié)

我們都知道下呼吸道樣本含有病毒載量更多,但是由于采樣不方便或者病人沒有痰,現(xiàn)在采集的樣本幾乎都是上呼吸道樣本,比如咽拭子。根據(jù)病人病程、醫(yī)護(hù)人員取樣操作的規(guī)范程度不同等原因,會出現(xiàn)采樣量不均一問題,也就是量多量少的問題,采集的樣本中病毒量少,假陰性的風(fēng)險就高。

因此,在采樣及運輸環(huán)節(jié),樣本采集是一個主要因素。

運輸環(huán)節(jié),目前的包裝和運輸條件全部使用國家CDC 標(biāo)準(zhǔn),對于樣本質(zhì)量的保證和風(fēng)險都是一致的,我們暫且不做討論。

 2、核酸提取環(huán)節(jié)

注意,這個環(huán)節(jié)從樣本滅活開始,到獲得樣本中RNA結(jié)束。而且樣本具有特殊性。

目前送檢樣本以咽拭子為主,極少量痰液。咽拭子擦取的是兩腭弓、咽及扁桃體部位的分泌物,這種分泌物與痰液的共同特點是有黏度、蛋白多、不易液化,處理困難。

如果有足量的樣本,現(xiàn)有的核酸提取方法也不是問題(無非就是處理麻煩些,需要的樣本量和試劑量比較大),問題就在于咽拭子和痰液本身就很難處理,而且采集的樣本量可能還非常少。

對于核酸檢測假陰性,現(xiàn)有觀點主要考慮核酸純化及qPCR,沒有考慮更靠前的樣本處理的重要性,比如出于對檢測人員的安全防護(hù),所有的樣本在核酸提取之前都需要進(jìn)行56℃,30分鐘的滅活處理。新冠病毒是RNA病毒,這一步滅活在一定程度上可能會造成病毒核酸降解影響后續(xù)核酸提取的得率和質(zhì)量,進(jìn)而影響下游檢測鑒定結(jié)果。

再比如樣本的裂解,使用裂解液裂解屬于化學(xué)法裂解,如果單純是細(xì)胞,化學(xué)裂解的效果是有保障的,但是如果是咽拭子或痰液這類樣本,化學(xué)裂解就很難裂解充分,導(dǎo)致病毒核酸釋放不夠,影響后續(xù)核酸提取得率(再是痕量樣本,困難可想而知)。

因此,在核酸提取環(huán)節(jié),針對咽拭子或痰液這種難處理且微量/痕量的樣本,處理方式才是影響病毒核酸提取得率的最主要的因素。

3、qPCR檢測環(huán)節(jié)

首先我們需要明確的是,要有病毒核酸存在,qPCR才能檢測出來。有專家在質(zhì)疑檢測試劑盒的質(zhì)量以及檢測手段,認(rèn)為應(yīng)該對不同廠商的試劑盒進(jìn)行系統(tǒng)對比,我們贊成這個做法,因為不排除有試劑盒原料、引物設(shè)計、產(chǎn)品質(zhì)控手段及產(chǎn)品批次間有差異。但是我們也要為大部分試劑盒生產(chǎn)廠家和儀器生廠商說句公道話:qPCR方法誕生于1996年,發(fā)展至今技術(shù)非常成熟,檢測靈敏度可低至1個拷貝,是當(dāng)今應(yīng)用于臨床的最先進(jìn)的核酸分子診斷技術(shù)之一。

因此,在qPCR 檢測環(huán)節(jié),檢測試劑盒是一個因素,還有一個影響因素是檢測技術(shù)人員的技術(shù)水平。值得慶幸的是,這兩個影響因素隨著試劑盒質(zhì)量和技術(shù)人員水平的不斷提升正在逐漸減少。

導(dǎo)致假陰性結(jié)果的四個因素

經(jīng)過總結(jié),我們不難發(fā)現(xiàn),在整個新冠肺炎樣本進(jìn)行核酸檢測過程中,導(dǎo)致假陰性結(jié)果的主要因素有4個:1、樣本采集;2、病毒核酸提取前的樣本處理方法;3、檢測試劑盒質(zhì)量;4、操作人員水平。

我們前面說過了,3和4這兩個因素一直在改善,目前和未來都不會成為最關(guān)鍵的因素。

經(jīng)過前面討論,現(xiàn)在最關(guān)鍵的影響因素已經(jīng)浮出水面了,那就是樣本采集和病毒核酸提取之前的樣本處理方法。也就是說如果沒有采集到樣本或者沒有提取到病毒的核酸分子,再牛的檢測試劑盒結(jié)果也只能是陰性。

臨床樣本采集有先天的局限性,可以說有很大一部分的假陰性是因為只采集到一點點的帶病毒樣本,這一點點樣本還有很多黏蛋白,很難裂解,想要提取到核酸還得能用于qPCR擴增可以說是非常困難的,假陰性的結(jié)果也變成情理之中了。 

那么面對這一點點還很難處理的樣本,我們就束手無策了嗎?

每一份痕量珍貴的樣本背后,都有一個亟待救治的患者,每一份檢測報告的背后,都是不止一位檢測工作者超過5個小時的風(fēng)險操作。

痕量黏性樣本,如何陰轉(zhuǎn)陽?

我們大膽的提議:在樣本量非常有限的情況下,我們要考慮解決的首要問題不是核酸提取試劑盒,而應(yīng)該是在核酸提取之前如何處理樣本,使這一點點樣本中的病毒核酸得以充分釋放。

也就是說在新冠肺炎病毒的整個檢測環(huán)節(jié)中,做好核酸提取前的樣本處理,從痕量難處理的樣本中充分釋放病毒核酸才是關(guān)鍵中的關(guān)鍵!改變核酸提取前的樣本處理方式有可能使假陰性的概率降低!

在臨床樣本采集量有限的情況下,我們要把目光投放在核酸純化前的樣本處理上,即通過更有效的手段,比如使用聚焦超聲技術(shù)的物理裂解方法結(jié)合化學(xué)裂解法對采集的樣本進(jìn)行病毒滅活、勻漿或者液化處理,充分釋放病毒核酸,使后續(xù)核酸純化獲得足夠且高質(zhì)量的病毒RNA,這是現(xiàn)有條件下提高檢測靈敏度的根基,可以減低可疑或者假陰性結(jié)果。

在呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus, RSV)的鑒定案例中,作者比較了Covaris聚焦超聲技術(shù)(AFA)(授權(quán)基因有限公司全國獨家代理)處理痰液結(jié)合MNAzyme探針法與Glass beads研磨方法處理痰液結(jié)合TagMan探針法對RSV病毒提取及擴增效率的影響。結(jié)果顯示,與Glass beads方法相比,經(jīng)Covaris AFA超聲法處理后提取的核酸樣本,檢測到的Ct值明顯減小(變化范圍1.0 - 4.0 log,靈敏度提高10-10000倍),即經(jīng)Covaris AFA超聲法處理的樣本提取的病毒RNA得率更高。尤其是在7號樣品中,使用Glass beads方法處理的樣本,檢測RSV-B呈陰性,而Covaris方法處理的樣本檢測結(jié)果為陽性。(如下表)

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在這個案例中,Covaris AFA超聲法(授權(quán)基因有限公司全國獨家代理)處理痰液的時間僅僅是30秒。這是因為聚焦超聲技術(shù)的聲波頻率(500kHz)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通水浴超聲,集中的能量可以在低溫條件下幾分鐘內(nèi)將病毒徹底滅活,同時充分釋放病毒核酸以便提高病毒核酸得率。既可以保護(hù)檢測人員的安全,又可以提高工作效率,降低假陰性概率。

下面這個分枝桿菌鑒定的案例,也充分證明了這一點。

分枝桿菌

分枝桿菌在自然界中普遍存在,在臨床上,可引發(fā)個體全身或局部的破壞性感染。由于不同種類的分枝桿菌感染需要不同的治療方案,因此菌株的快速準(zhǔn)確鑒定對于疾病診斷和有效的抗生素治療至關(guān)重要。

常規(guī)方法(高溫滅活和珠子處理)完成一次菌株滅活及多肽提取需要95.5分鐘,其中95℃滅活30分鐘,使用聚焦超聲技術(shù)完成一次菌株滅活及多肽提取僅需4.5分鐘,其中18℃滅活僅需2分鐘,接受測試的21個種屬182份樣品在2分鐘處理條件下完全滅活。比傳統(tǒng)方法節(jié)約28分鐘。

處理后的樣本使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,利用Covaris AFA技術(shù)處理的樣本鑒定所得到的平均置信度得分Log值為2.07(1.90-2.26),而傳統(tǒng)方法提取鑒定的平均得分為1.96(1.52-2.20)。并且,當(dāng)使用 2.0作為cut-off臨界值時,AFA鑒定的準(zhǔn)確率為66.7%,而傳統(tǒng)方法則為41.7%;當(dāng)分別以 1.8和 1.7作為cut-off臨界值時,傳統(tǒng)方法的準(zhǔn)確率為66.7%和83.3%,而AFA方法鑒定的準(zhǔn)確率為100%。(見下表)

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(注:得分表示未知樣品的質(zhì)譜圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知樣品的圖譜的相似程度,Log值越高,表明待測樣品的細(xì)菌蛋白質(zhì)鑒定的靈敏性和準(zhǔn)確度越高)

同時作者還發(fā)現(xiàn),使用Covaris AFA聚焦超聲處理的菌株,在鑒定時的重復(fù)性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)處理方法。具體表現(xiàn)為:在以 1.7作為cut-off臨界值時,AFA聚焦超聲提取樣品2-4個重復(fù)點鑒定的一致性為100%,而傳統(tǒng)方法鑒定需要4個點的重復(fù)才能達(dá)到77.5%的一致性,2個點重復(fù)時僅有38.3%。(見下表)

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由此可見,對于常規(guī)方法難以獲得理想提取效果的臨床樣本,比如新冠肺炎的咽拭子或痰液樣本,只需要在核酸提取之前加一步Covaris AFA超聲處理(授權(quán)基因有限公司全國獨家代理),即可在極短時間內(nèi)將病毒完全滅活且不影響RNA 提取質(zhì)量,充分釋放醫(yī)學(xué)樣本中的病毒核酸,提高后續(xù)病毒核酸提取得率,從源頭上提高檢測靈敏度,降低假陰性概率。

基于聚焦超聲技術(shù)的高性能樣本處理方法 

Covaris 自動聚焦聲學(xué)技術(shù) (Adaptive Focused Acoustics ,AFA) (授權(quán)基因有限公司全國獨家代理)作用于微量珍貴臨床樣本,可以有效提高核酸得率。該技術(shù)整合了非線性、高強度、會聚性聲學(xué)沖擊波和高級計算機控制系統(tǒng)。通過圓盤狀傳感器將聲波能量聚焦在樣品上,且能量強度可控,采用非接觸并等溫的方式進(jìn)行樣品的勻漿或混勻。

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Adaptive Focused Acoustics ,AFA

如果您的實驗室里有Covaris AFA 樣本處理系統(tǒng),并且您的實驗室正在進(jìn)行新冠肺炎病毒相關(guān)的檢測工作,請聯(lián)系基因有限公司技術(shù)支持團隊marketing@genecompany.com,我們愿意為您提供我們能力范圍內(nèi)最大的支持,與您一起,攻克難關(guān)。

 

參考文獻(xiàn):

1 David Nauwelaersa,?, Leen Vijgenb et al. Development of a real-time multiplex RSV detection assay for difficult respiratory samples, using ultrasone waves and MNAzyme technology  Journal of Clinical Virology 46 (2009) 238–243

2La’Tonzia, L. Adams, et al.  A Rapid Standardized Protein Extraction Method Using Adaptive Focused Acoustics for Identification of Mycobacteria by MALDI-ToF MS. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (2016).???

 

基因有限公司作為一家專業(yè)性的生命科學(xué)儀器、試劑供應(yīng)商,自1992年成立以來一直秉承著“Let Professionals Serve Professionals”的宗旨,力求將最先進(jìn)的技術(shù)方法推薦到國內(nèi),為廣大客戶提供包括技術(shù)咨詢、產(chǎn)品選配、售后培訓(xùn)及維護(hù)的專業(yè)服務(wù)體系,并作為Covaris 在中國的合作伙伴,可為感興趣的客戶提供專業(yè)的產(chǎn)品咨詢、技術(shù)答疑及聯(lián)系試用等,索取資料聯(lián)系91儀器信息網(wǎng)。

基因有限公司市場部

2020年2月11日

 文源:基因有限公司


 
 
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