在此次新型冠狀病毒疫情中，作為最終確診的關(guān)鍵性技術(shù)，核酸檢測(cè)發(fā)揮了及其重要的作用。但是近期關(guān)于核酸檢測(cè)準(zhǔn)確性問(wèn)題的討論甚囂塵上，如何提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，如何減少假陰性/假陽(yáng)性成為困擾檢測(cè)工作者的重要難題。

從目前已有的資料來(lái)看，很多方面得到了討論，如：冠狀病毒感染人體后，病變主要發(fā)生肺部，即下呼吸道，上呼吸道咽部病毒含量低，通過(guò)咽拭子檢測(cè)常常出現(xiàn)陰性，再加上其他一些因素，比如：采樣不規(guī)范，運(yùn)輸和存儲(chǔ)等造成病毒RNA降解，核酸檢測(cè)試劑盒的快速審批入市，質(zhì)量參差不齊等等，這些環(huán)節(jié)都可能導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。同時(shí)各環(huán)節(jié)操作的不規(guī)范，還容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的發(fā)生。

而從核酸提取質(zhì)量，熒光定量PCR各品牌，各型號(hào)的對(duì)核酸檢測(cè)試劑的適應(yīng)性的討論就不多見(jiàn)了，本文就病毒核酸提取、qPCR檢測(cè)、體系加樣等環(huán)節(jié)，在耶拿公司產(chǎn)品的基礎(chǔ)上提出了一系列解決方案， 供大家參考。

一、核酸提?。?/p>

作為核酸檢測(cè)的起始步驟，病毒核酸能否被高效安全的從樣本中提取出來(lái)，將會(huì)成為整個(gè)核酸檢測(cè)至關(guān)重要的一步。在多數(shù)核酸提取的過(guò)程中，操作者將面臨如下幾類問(wèn)題：

1、咽拭子、血清、血漿等上樣量不足，現(xiàn)在普遍是200 L的上樣體積，病毒獲得不足，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；

2、病毒富集效率低、裂解不充分，導(dǎo)致核酸產(chǎn)物收率較低而引起的假陰性結(jié)果；

3、提取產(chǎn)物富含高濃度鹽分、有機(jī)物等PCR抑制劑殘留，對(duì)后續(xù)定量PCR檢測(cè)產(chǎn)生抑制產(chǎn)生假陰性結(jié)果；

4、提取過(guò)程中過(guò)度的剪切力將本來(lái)含量不高的病毒核酸破環(huán)，病毒核酸完整度差，無(wú)法作為后續(xù)熒光定量PCR模板而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果；

5、手工提取過(guò)程復(fù)雜，步驟繁多增加交叉污染概率而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果；

6、常規(guī)磁棒法全自動(dòng)核酸提取儀因磁棒磁力下降導(dǎo)致磁珠殘留，進(jìn)而導(dǎo)致交叉污染出現(xiàn)假陽(yáng)性/假陰性結(jié)果。

解決方案

德國(guó)耶拿公司InnuPure C16 touch全自動(dòng)核酸提取儀，Cybio-Felix全能型工作站將人們從繁瑣的核酸提取純化過(guò)程中解放出來(lái)，大大提高了工作效率和產(chǎn)物質(zhì)量。您只需要加入樣本，選擇相應(yīng)的提取程序，按下“開(kāi)始”即可輕松獲得純凈的核酸。

l 耶拿公司的C16 Touch核酸提取儀，最大上樣體積可到600 L，加大上樣量可以獲得更多核酸，降低假陰性的產(chǎn)生

l 產(chǎn)物無(wú)磁珠殘留，有效防止交叉污染，降低假陽(yáng)性；提取結(jié)果重復(fù)性、均一性更好

其配套的針對(duì)病毒提取的相關(guān)試劑擁有如下兩項(xiàng)專利：

◆ Dual Chemistry Technology

2005年耶拿公司發(fā)明了專利性的核酸提取技術(shù)DC-Technology（雙緩沖液技術(shù)），采用獨(dú)特的裂解緩沖液和新型的結(jié)合緩沖液，無(wú)需使用高鹽結(jié)合，提高核酸提取得率，以及更為完整的核酸片段，降低假陰性可能。

◆ Smart Extraction技術(shù)—新一代核酸提取技術(shù)

  2016年耶拿公司又發(fā)明了專利性的新一代提取技術(shù)Smart Extraction，該技術(shù)打破常規(guī)核酸提取需要借助介質(zhì)吸附核酸的傳統(tǒng)，提取過(guò)程無(wú)需酚/氯仿、無(wú)需離子交換、無(wú)需離心柱、無(wú)需硅膠膜、無(wú)需磁珠，僅需tip上下吹打即可完成。提取得到的核酸得率高、完整度高，純度好，降低假陰性的可能性。

二、熒光定量PCR檢測(cè)：

當(dāng)檢測(cè)工作者收獲了高質(zhì)量、低雜質(zhì)的樣本核酸后，熒光定量PCR過(guò)程中的檢測(cè)靈敏度、特異性、重復(fù)可靠性就成為了獲取高質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果最至關(guān)重要的因素了。

1、基于儀器老化、設(shè)計(jì)缺陷等原因?qū)е碌臒晒舛縋CR儀溫度控制的準(zhǔn)確性、均一性不高，結(jié)果擴(kuò)增效率較低或者批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性不佳，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

2、不同型號(hào)儀器采用不同的激發(fā)光源對(duì)結(jié)果會(huì)有一定影響，某些光源使用一定時(shí)間沒(méi)有更換，對(duì)付近期的高強(qiáng)度檢測(cè)工作會(huì)進(jìn)一步降低儀器的靈敏度，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

3、各類熒光定量PCR所采用的檢測(cè)器靈敏度是存在差異的，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

基于以上問(wèn)題

德國(guó)耶拿公司qTOWER3系列熒光定量PCR儀，以其卓越的溫控系統(tǒng)帶來(lái)快速穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，先進(jìn)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)帶來(lái)高靈敏度的檢測(cè)。

l 鍍金純銀樣品槽，采用熱傳遞性非常好的銀質(zhì)材料，快速的升降溫速率能夠加快實(shí)驗(yàn)速度，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。準(zhǔn)確的溫度控制帶來(lái)優(yōu)異的溫度均一性，進(jìn)而帶來(lái)各樣品間以及各批次間穩(wěn)定的定量PCR擴(kuò)增結(jié)果。

l 采用藍(lán)色、綠色、紅色、白色四個(gè)高強(qiáng)度長(zhǎng)壽命LED固態(tài)光源，確保在整個(gè)光譜檢測(cè)范圍內(nèi)都有很強(qiáng)的激發(fā)光強(qiáng)，有利于較弱信號(hào)的采集，從而提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度，減少假陰性可能。LED光源壽命長(zhǎng)，免維護(hù)，節(jié)約后續(xù)的使用成本。

l 采用定量PCR儀上最新一代的通道式光電倍增管（CPM）檢測(cè)器，有效降低背景噪音信號(hào)，檢測(cè)靈敏度比CCD或PMT（普通光電倍增管）高，提高檢測(cè)靈敏度，減少假陰性可能。

三、液體處理過(guò)程：

近期，各類關(guān)于檢測(cè)工作繁重，人員壓力大，復(fù)檢次數(shù)眾多等，相繼被各類媒體爭(zhēng)相報(bào)道。由此可見(jiàn)，面對(duì)如此重大的疫情，檢測(cè)人員所面對(duì)的工作壓力是非常巨大的。

1、在復(fù)雜的檢測(cè)工作中試劑、樣本的錯(cuò)加、漏加都成為假陰性、假陽(yáng)性產(chǎn)生的主要來(lái)源之一；

2、液體處理中的交叉污染也成為了檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。

在如今的新時(shí)代，各類全自動(dòng)液體處理工作站已經(jīng)在全球各個(gè)生命科學(xué)、疾病藥物診斷研發(fā)、政府機(jī)構(gòu)的高通量檢測(cè)領(lǐng)域中得到廣泛的使用。德國(guó)耶拿公司建議除了前面提到的核酸提取步驟可以采用全自動(dòng)液體處理工作站高效的完成之外，PCR的體系構(gòu)建等工作也可以采用類似的方法來(lái)解決。

德國(guó)耶拿公司Cybio-Felix全能型液體處理工作站，可自動(dòng)完成定量PCR反應(yīng)中涉及到的各類預(yù)混液、引物、模板、去離子水 等的加樣，代替手工快速、準(zhǔn)確、高效地進(jìn)行定量PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建，適用于各類PCR體系及成品試劑盒的液體處理。

1、超高的移液準(zhǔn)確性：確保在小體積量程下實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確地加入模板內(nèi)并且準(zhǔn)確地分裝反應(yīng)體系，有效的減少因加樣產(chǎn)生的假陰性結(jié)果；

2、PCR體系構(gòu)建快速高效，提高檢測(cè)效率，讓更多的疑似患者能夠盡快明確：可在半小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)整版PCR體系構(gòu)建；若采用整板的預(yù)混Mix，則完成速度更快；

3、有效避免交叉污染：儀器運(yùn)行時(shí)完全封閉，避免環(huán)境污染；采用帶濾芯的tip，避免移液頭污染；UV燈滅菌，避免批間污染。且PCR體系構(gòu)建速度較快能減少模板中DNA的揮發(fā)，減少系統(tǒng)內(nèi)核酸氣溶膠的濃度大幅減少假陽(yáng)性的發(fā)生概率；

4、提供可放置入于生物安全柜中的型號(hào)，避免各類污染，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員安全。

核酸檢測(cè)結(jié)果是否可信，并不能一概而論，如果檢測(cè)儀器、試劑盒都沒(méi)有問(wèn)題，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都控制的很好，那么結(jié)果就非常可信，反之則無(wú)法判斷。

讓我們齊心協(xié)力，用我們自己的專業(yè)知識(shí)來(lái)共同對(duì)抗疫情。