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武漢同濟醫(yī)院檢驗科實戰(zhàn)經(jīng)驗:新冠病毒檢測常見問題處理

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2020-01-31  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):868
核心提示:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科新型冠狀病毒流行地區(qū)臨床實驗室常見問題解答(第一版) 1. 分子生物學(xué)實驗室的生物安全和個人防護要求如何? 生物安全二級及以上實驗室條件和生物安全三級實驗室級別的個人防護,如一次性醫(yī)用防護服、護目鏡、雙層手套、醫(yī)用防護口罩(如3M公司的1860/9132醫(yī)用N95口罩,口罩必須做氣密性檢測)、防護靴套。口罩等防護用品的佩戴一定要正確,否則等同于無防護。三級防護的個人需保證休整時間,連續(xù)工作4個小時以上會因缺氧而導(dǎo)致乏力、頭暈等不良反應(yīng)。需正確識別高強度工作狀態(tài)下的身

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科

新型冠狀病毒流行地區(qū)

臨床實驗室常見問題解答

(第一版)

1. 分子生物學(xué)實驗室的生物安全和個人防護要求如何?

生物安全二級及以上實驗室條件和生物安全三級實驗室級別的個人防護,如一次性醫(yī)用防護服、護目鏡、雙層手套、醫(yī)用防護口罩(如3M公司的1860/9132醫(yī)用N95口罩,口罩必須做氣密性檢測)、防護靴套??谡值确雷o用品的佩戴一定要正確,否則等同于無防護。三級防護的個人需保證休整時間,連續(xù)工作4個小時以上會因缺氧而導(dǎo)致乏力、頭暈等不良反應(yīng)。需正確識別高強度工作狀態(tài)下的身體不適與病毒感染引起的早期癥狀的區(qū)別,避免產(chǎn)生不必要的心理壓力。

2. 發(fā)熱門診的血液、大小便樣本的處理和檢測如何開展?

是否需要單獨開辟獨立的空間和設(shè)施?

中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS)可在呼吸道樣本、血液和糞便樣本中檢出,同科屬的新型冠狀病毒(2019-nCoV)潛在具有上述特性。目前的資料表明:經(jīng)呼吸道飛沫傳播是2019-nCoV的主要傳播途徑,亦可通過接觸傳播(如手-口途徑、糞-口途徑)。因此來自2019-nCoV感染病人的非呼吸道樣本也具有潛在的感染性,應(yīng)盡量避免暴露環(huán)節(jié)(如不開蓋的血常規(guī)檢測模式)以及避免產(chǎn)生氣溶膠(離心后靜置)。不可避免的暴露性操作(如開蓋等)應(yīng)在生物安全柜中進行。由于感染者和非感染者難以區(qū)分,應(yīng)將所有樣本視為具有感染性(標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防),在條件不允許的情況下可不設(shè)立獨立的檢測空間,但工作人員必須佩戴外科口罩或醫(yī)用防護口罩等個人防護措施,并保證環(huán)境的生物安全。對疑似病人樣本給予更高的重視,對處理后樣本、廢棄物及環(huán)境執(zhí)行更嚴(yán)格、頻繁的消毒滅菌措施(見下述第6條)。

3. 樣本的轉(zhuǎn)運流程?

可依據(jù)“國衛(wèi)辦醫(yī)函【2020】53號”文件執(zhí)行。

院內(nèi)運輸:樣本由醫(yī)護人員采集后,放入兩層一次性密封袋內(nèi)密封,置于樣本轉(zhuǎn)運箱后,與樣本運送人員交接,樣本由專人運送入實驗室。樣本運送過程中,運送人員應(yīng)佩戴帽子、一次性外科口罩、手套、隔離衣。

院外運輸:按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部令第45號)要求執(zhí)行。

4. 病毒滅活處理方法?

文獻及指南報道,56℃ 30 min可滅活冠狀病毒,我們的初步試驗表明,干浴(烤箱或恒溫箱)56℃ 30min或50℃ 60min的滅活方式不影響呼吸道樣本中RNA病毒的檢測(見圖1)。時間所限,我們對于此次新冠病毒的評估尚未完成,將在再版中更新這一內(nèi)容。

微信圖片_20200131120406.jpg

圖1 不同滅活方式對PCR檢測結(jié)果的影響

根據(jù)上述結(jié)果,并綜合其它資料,為了減少感染樣本對人和環(huán)境的潛在危害,我們初步推薦:呼吸道樣本(微生物等培養(yǎng)目的除外)先56℃干浴 60 min,靜置10 min至室溫(避免氣溶膠),然后進行處理。

但必須強調(diào)的是,病毒滅活效果與其所在基質(zhì)成分有關(guān),因?qū)嶒灄l件所限,我們無法評估該方法滅活病毒的真實效果。此外,我們選擇干浴后靜置10 min是基于我們現(xiàn)有的樣本量及實驗條件。理論上,干浴后靜置的時間越長,產(chǎn)生氣溶膠的風(fēng)險越小?;诖?,干浴處理后的樣本仍視為具有感染性,其后續(xù)處理應(yīng)視同未滅活的樣本。

5. 廢棄物如何處理?

對檢測完成后的疑似病人樣本采用雙層塑料袋密封;對實驗過程中產(chǎn)生的廢液和槍頭等置于含0.5%~1%有效氯的含氯消毒液的廢液缸。上述物品經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理。詳見《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》(第三版)。

6. 檢驗科如何合理設(shè)置呼吸道樣本檢測項目組合?

依據(jù)方便(臨床采樣和檢驗科檢測)和安全原則對項目組合進行安排。2019-nCoV核酸檢測項目宜單獨申請,單獨采樣,方便檢測。其它呼吸道病毒核酸檢測項目(流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒等)則可單獨和/或組合申請。所有呼吸道樣本均應(yīng)視為潛在的感染源,并做相應(yīng)處理和防護。更重要的是建立一套完善的有關(guān)2019-nCoV檢測的管理機制,涵蓋項目申請、檢測時限、報告時間、報告方式、對內(nèi)對外聯(lián)系,以及分析前、中、后各種環(huán)節(jié)。

7. 生物安全柜的選擇和使用注意事項?

對潛在含有2019-nCoV的呼吸道樣本的操作應(yīng)在生物安全柜(biosafety cabinet)中進行,工作狀態(tài)下遵守操作規(guī)程可保證工作人員不受侵害。生物安全柜檢定合格方能使用(包括外觀和功能、潔凈度等級、垂直氣流平均風(fēng)速、工作窗口進風(fēng)平均風(fēng)速、照度、噪音、氣流狀態(tài))。

操作注意事項:

⑴風(fēng)機運行至少5min后方可開始操作;

⑵柜內(nèi)盡量少放物品,以免影響氣流循環(huán);

⑶避免干擾氣流,不良行為包括手臂頻繁出入,操作者身后人員頻繁走動,阻擋空氣格柵;

⑷在中后部操作,并不影響透過玻璃擋板觀察;

⑸柜內(nèi)不可進行文字工作;

⑹風(fēng)機運行至少5 min后方可關(guān)機;

⑺工作完成后、每天下班前,使用適當(dāng)消毒劑擦拭表面。

8. 在防護用品不能完全達到要求的時候,怎樣最大程度地自我保護及進行實驗室安全防護?

無論防護條件是否滿足要求,標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防、不定期通風(fēng)和手衛(wèi)生是最重要的防護措施。

此外,必須牢記三個防控要素。

⑴人員:必須有安全意識,不能麻痹大意,以往及當(dāng)下的經(jīng)驗教訓(xùn)表明安全意識越強,感染的幾率越小。

具體措施:

①無論是否處于工作狀態(tài),無論是否在病房或是其它環(huán)境,佩戴口罩,不到萬不得已的情況,比如吃飯、喝水,都不要摘下,如果需要摘下口罩,強烈建議先進行手消毒再摘下口罩;

②醫(yī)務(wù)人員盡量避免集體就餐,最好是分次就餐,減少小范圍群體性暴露;

③直接面對病人的窗口工作人員和接觸呼吸道樣本的相關(guān)人員必須嚴(yán)格執(zhí)行生物安全三級實驗室級別的個人防護。

⑵操作:必須視所有樣本為潛在感染源,實行標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施。對高危的呼吸道樣本(檢測核酸或抗原)在送達實驗室之前滅活(見上述方法和圖1),可最大程度減少生物危害。處理呼吸道樣本必須在生物安全柜中進行,操作過程輕柔避免飛濺。實驗過程中產(chǎn)生的污物必須高壓滅菌后才能運出實驗室。

⑶環(huán)境:桌面、儀器、固定設(shè)施及地面至少每日采用0.5%~1%含氯消毒液擦拭。含氯消毒液(注意,洗必泰[氯己定]不能有效滅活病毒)、75%的酒精等消毒物品應(yīng)隨手可及,便于隨時消毒。PCR實驗結(jié)束后應(yīng)紫外照射房間及相關(guān)設(shè)施以消除核酸污染,同時殺滅病毒。紫外消毒時必須保證門窗緊閉。

9. 樣本類型?采集流程和容器?

呼吸道樣本(包括咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物、痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等)均可。為了減少污染流程可相對固定一種樣本類型及操作簡便的方法,以便更好實施(除特殊情況下需采集特定的樣本)。對自動核酸提取方法而言,采用帶病毒保存液的咽拭子或鼻咽拭子可避免開蓋添加生理鹽水的步驟。采樣人員必須嚴(yán)格執(zhí)行生物安全三級實驗室級別的個人防護。樣本采集質(zhì)量嚴(yán)重影響檢測結(jié)果,需對采樣人員進行專業(yè)培訓(xùn),如咽拭子采集應(yīng)擦拭兩側(cè)腭弓和咽、扁桃體的分泌物。

10. 核酸提取方法、試劑的選擇?

目前RNA提取方法眾多,實驗室應(yīng)選擇簡便、高效的核酸提取方法。我們當(dāng)前使用的蛋白酶K消化,磁珠分離的全自動核酸提取方法證明有效。由于2019-nCoV感染是突發(fā)事件,各種試劑通過快審進入臨床最大程度解決了臨床急需,但當(dāng)前存在以下兩方面的問題給結(jié)果的報告和解釋造成了較大的困擾。

⑴不同試劑盒陽性檢出率存在較大差別;

⑵一部分試劑盒檢測ORF1ab和E及N基因,另一部分試劑盒只檢測ORF1ab和N基因,部分試劑的單陽性結(jié)果占陽性結(jié)果的20%以上。

另一個值得關(guān)注的問題是試劑的選擇還需與實驗室的硬件設(shè)備相匹配,如有的儀器對PCR擴增管有特別要求(100 L或者200 L)等。

11. 報告模板?

基于上述問題,我們建議以陽性、可疑和陰性三種結(jié)果進行報告,對單陽性的結(jié)果及可疑結(jié)果建議采用不同試劑盒進行復(fù)核,并進行備注(圖2)。部分地區(qū)可將陽性和可疑的樣本送CDC確證。

微信圖片_20200131120442.jpg

圖2 同濟檢驗科2019-nCoV核酸檢測報告模板

參考文獻:

1. 國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于醫(yī)療機構(gòu)開展新型冠狀病毒核酸檢測有關(guān)要求的通知.國衛(wèi)辦醫(yī)函【2020】53號

2. 關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第四版)的通知. 國衛(wèi)辦醫(yī)函【2020】77號

3. 新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第三版)

4. Real-Time RT-PCR Panel for Detection 2019-Novel Coronavirus.

https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html

5.https://mp.weixin.qq.com/s/uWiOOpfxQH4c77rAFXfNgQ

 
 
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