抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情，這場發(fā)生在屬相輪回之交的“戰(zhàn)役”愈演愈烈?！皯?zhàn)役”之初，因試劑盒短缺而導致被病毒感染的人無法及時確診，甚至有人因次錯過有效的針對性治療而喪失生命。

在1月21日病毒病預(yù)防控制所發(fā)布新型冠狀病毒核酸檢測引物和探針序列后，多家企業(yè)開始研發(fā)出病毒檢測試劑。1月25日，國家藥監(jiān)局為7家新型冠狀病毒檢測試劑盒生產(chǎn)商開通快速審批通道，同一天，湖北省實行新型冠狀病毒檢測試劑盒先試用后申報的辦法。而今，已有數(shù)十家企業(yè)在夜以繼日的生產(chǎn)著這關(guān)乎性命的試劑盒，并且已有4家企業(yè)的檢測產(chǎn)品相繼獲得國家藥品監(jiān)督管理局注冊證。

那么，這個在此次抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情戰(zhàn)役中進入公眾視線的病毒試劑盒究竟是什么？

檢測試劑盒，顧名思義，是一個裝有檢測某樣目標物質(zhì)所需試劑的小盒子。只需要按照廠商隨盒附上的說明書進行加樣操作，便能進行檢測。試劑盒所提供的方案，是經(jīng)過多次實驗所產(chǎn)出的最優(yōu)解，包括試劑濃度、加樣量等，以保證結(jié)果的可靠性和準確性。除卻檢測試劑盒，另有核酸提取試劑盒、ELISA試劑盒、特定蛋白檢測試劑盒以匹配不同操作平臺和實驗?zāi)康模覀兿劝聪虏槐怼?/p>

目前，用于檢測新型冠狀病毒的試劑盒多采用熒光PCR方法，在獲取病毒樣本當天即可出具病毒核酸檢測結(jié)果。短短一月間，從發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒，到研發(fā)出病毒檢測試劑盒，這一切，離不開科研人員、國家等多方的迅速反應(yīng)。

實際上，開發(fā)一個核酸診斷試劑盒到它真正上市投入使用，短則2-3年，長則4-5年。這里，我們將結(jié)合此次2019-nCoV病毒檢測來大致介紹核酸檢測試劑盒的開發(fā)流程。

科普時間：

核酸檢測試劑盒開發(fā)流程

引物與探針設(shè)計

引物：分為正向和反向引物，通過對GC含量（50%-60%）的控制來避免引物二聚體形成以及 控制退火溫度。一般會把此次病毒病預(yù)防控制所發(fā)布的兩對引物，GC含量都在50%左右且退火溫度均維持在50-60℃之間。

探針：使用探針以增加擴增子的特異性，減少假陽結(jié)果。探針序列必須有別于引物序列，且C含量多于G含量，過高的G含量會降低反應(yīng)效率。探針的長度控制在18-30bp最佳，過長會導致淬滅效果不佳。圖1展示的兩個探針長度分別為28和20bp。

圖1：病毒病預(yù)防控制所公布的新型冠狀病毒核酸檢測引物和探針序列

擴增子：即目的病毒核酸擴增片段，同理，選擇含有特定GC量的片段來避免形成二級結(jié)構(gòu)，長度在60-120bp。

我們在這里只是粗略地介紹了引探設(shè)計中需要考慮的因素，即便從理論出發(fā)所設(shè)計的引物與探針看似一切無虞，但在實際操作中仍會出現(xiàn)各式各樣的問題，在后文我們會提及體系優(yōu)化以達到最佳檢測效果。

模板制備

首先需要明確模板類型，此次需要檢驗的2019-nCoV病毒便是單股正鏈RNA病毒。

現(xiàn)下的新冠肺炎是呼吸道疾病，且可由飛沫進行傳播，咽部是病毒高度聚集的部位，因此樣本采集途徑是收集就診者咽拭子標本或者是痰液；所有的樣本模板制備過程中都進行純化和質(zhì)控管理。

體系優(yōu)化

聚合酶在這個實際體系優(yōu)化中作為最重要的關(guān)鍵原料，這對檢測試劑盒的靈敏度，特異性，重復(fù)性，擴增效率等性能指標至關(guān)重要。

催化酶的優(yōu)化在最初期，廠家會選擇多家供應(yīng)商的產(chǎn)品進行測試，目的是選擇最適合該反應(yīng)體系的催化酶。而原料供應(yīng)商提供的聚合酶配套的buffer也往往非工業(yè)生產(chǎn)過程中的最優(yōu)配方，需要不斷調(diào)試離子濃度，pH值等以達到最佳反應(yīng)體系。

探針濃度的優(yōu)化主要依靠背景信號強度、探針與靶的結(jié)合效率、PCR擴增的效率、引物的濃度等進行優(yōu)化。目的是既使背景熒光最小化，又沒有降低實驗的敏感性，從而得到最佳實驗結(jié)果。

引物也需要濃度優(yōu)化，并且在設(shè)計過程中，會準備多對引物與探針匹配，選擇能夠給出最低Ct值，到達但是卻能給出最高反應(yīng)終點熒光值的引物。（Ct值：即熒光量到達閾值所需的循環(huán)數(shù)）

對于引物退火溫度，理論值與實際溫度會有一定出入，通常使用梯度PCR來確定最佳效率的退火溫度。

由于2019-nCoV與SARS CoV高度同源，因此還需制備陽性對照來避免假陽性的可能。（假陽性：一般來說，陽性（+）是表示疾病或體內(nèi)生理的變化有一定的結(jié)果。相反，化驗單或報告單上的陰性（－），則多數(shù)基本上否定或排除某種病變的可能性。然而，由于環(huán)境因素、操作因素、實驗方法或者患者自身因素等等可能把不具備陽性癥狀的人檢測出陽性的結(jié)果）

性能檢測

當一切準備就緒后，就需要進行性能測試，而這也是最耗費時間的。

大致為：

靈敏度測試、重復(fù)性測試、穩(wěn)定性測試、最低檢測濃度、特異性及其他干擾物質(zhì)的影響、精密度分析等。

以上就是大致的熒光PCR核酸檢測試劑盒研發(fā)流程，每一個環(huán)節(jié)都需要多次確認才得以成就最后產(chǎn)品。在這場舉國防控防疫攻堅戰(zhàn)中，檢測試劑盒的出現(xiàn)為廣大一線醫(yī)務(wù)工作者提供了有利工具，再結(jié)合臨床檢查，加快病情排查。普通流感與新冠肺炎癥狀類似，對于前往發(fā)熱門診的病患來說，試劑盒的存在也讓他們吃了一顆定心丸，盡快確診病情便可著手進行治療。

從“一盒難求”到“先試后報”

為何現(xiàn)在試劑盒仍舊供不應(yīng)求？首先，正值春節(jié)，工廠產(chǎn)能有限、物流人手有限；其次，2019-nCoV具有高傳染性，因此對于檢驗實驗室和檢驗人員都有一定要求，并非每一家醫(yī)院都有配備負壓條件的實驗室。但是我們同時也非常欣喜地看到，截止目前，共有7家企業(yè)研發(fā)的新型冠狀病毒檢測試劑盒進入了國家藥監(jiān)局的快速審批通道，湖北省更是提出采取先試用后申報的辦法，允許在醫(yī)療機構(gòu)先試用，疫情解除后再按程序?qū)徍恕?/p>

小彩蛋：

默克作為體外診斷試劑的原料供應(yīng)商，疫情發(fā)生以來，就收到來自全國各地的檢測試劑盒原料供應(yīng)需求，默克員工春節(jié)不休，全球調(diào)貨以滿足眾多檢測試劑盒生產(chǎn)廠家的需求。

默克核酸檢測試劑盒原料解決方案:

項目

核酸提取

引物探針合成

PCR/qPCR

原料

液體蛋白酶k

亞磷酰胺

Tween20

固體蛋白酶k

快速脫保護

試劑Cap A

礦物油

磁珠

乙腈

HEPES

鹽酸胍

三乙基胺

DNase

異硫氰酸胍

Atto熒光劑

RNase

PEG

定制化Oligo合成業(yè)務(wù)

RNase

抑制劑

SDS

定制化探針

合成業(yè)務(wù)

Taq 酶