91儀器信息網(wǎng)訊 2020年1月16日，《Science》雜志刊登了美國科學(xué)家David Hoffman和Gleb Shtengel在Hess和加州大學(xué)伯克利分校高級研究員Eric Betzig的指導(dǎo)下的一項關(guān)于融合超分辨率熒光和電子顯微鏡技術(shù)的顯微表征新技術(shù)成果，該技術(shù)稱為cryo-SR / EM，結(jié)合使用超低溫超高分辨率熒光顯微鏡和聚焦離子束銑削掃描電子顯微鏡，可以在整個細(xì)胞的三個維度上可視化蛋白質(zhì)-超結(jié)構(gòu)關(guān)系。憑借其重要性，該研究也榮登本期《科學(xué)》雜志封面。

封面為哺乳動物小腦顆粒神經(jīng)元的半透明彩色核，這張3D效果圖展示了由電子顯微鏡(EM)和低溫超分辨率熒光顯微鏡所成像的組蛋白重疊所定義的特異性異染色質(zhì)亞區(qū)類型。圍繞細(xì)胞核的半透明薄殼代表核膜，而3D渲染的電鏡數(shù)據(jù)(灰色)薄片則穿過細(xì)胞核。右下角的圓圈是線粒體的剖視圖。

一種新的顯微鏡技術(shù)將電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡相結(jié)合，以生成細(xì)致的三維細(xì)胞圖像，如圖所示。圖片來源：D. Hoffman et al./Science 2020

有觸須的的囊泡在很小的空間內(nèi)穿梭負(fù)責(zé)將“貨物”進(jìn)行分類，相鄰的神經(jīng)元通過類似網(wǎng)絡(luò)的界面相互依附。隨著干細(xì)胞分化成神經(jīng)元，DNA在核內(nèi)重新排列。而一項新的顯微鏡技術(shù)可以將所有這些細(xì)節(jié)展現(xiàn)得淋漓盡致。

這項技術(shù)被稱為cryo-SR/EM，它將電子顯微鏡和超分辨率光學(xué)顯微鏡捕捉到的圖像融合在一起，以3D的形式呈現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)部明亮、清晰、詳細(xì)的圖像。

技術(shù)背景

多年來，科學(xué)家一直在探索細(xì)胞內(nèi)部的微觀世界，開發(fā)新的工具來觀察這些基本的生命單位。但是每種工具都需要綜合權(quán)衡。光學(xué)顯微鏡可以通過熒光分子標(biāo)記特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠輕松識別，隨著超分辨(SR)熒光顯微鏡的發(fā)展，可以更加清晰的觀察這些結(jié)構(gòu)。但是，在一個給定的時間內(nèi)，熒光只能揭示細(xì)胞中10000多種蛋白質(zhì)中的一小部分，因此很難理解這幾種蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的關(guān)系。另一方面，電子顯微鏡(EM)可以在高分辨率的圖片中顯示出所有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)——但是僅僅通過EM來描述一個特征與其他特征是很困難的，因為細(xì)胞內(nèi)部的空間是如此的擁擠。

霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所珍妮莉亞研究園區(qū)的高級負(fù)責(zé)人Harald Hess說，“將這兩種技術(shù)結(jié)合在一起，可以使科學(xué)家清楚地了解特定細(xì)胞特征如何與其周圍環(huán)境相關(guān)聯(lián)，這是一種非常強大的方法?！?/p>

Janelia科學(xué)家David Hoffman和高級科學(xué)家Gleb Shtengel在Hess和加利福尼亞大學(xué)伯克利分校HHMI研究人員Eric Betzig的高級研究員Eric Betzig的帶領(lǐng)下率先開展了該項目。

首先，科學(xué)家在高壓下冷凍細(xì)胞。這樣可以迅速停止細(xì)胞的活動，防止冰晶的形成，而冰晶會破壞細(xì)胞并破壞成像的結(jié)構(gòu)。接下來，研究人員將樣品置于低溫室中，在絕對零度以上10度的溫度下，用超分辨率熒光顯微鏡對樣品進(jìn)行三維成像。然后，它們被移除，嵌入樹脂中，并在Hess實驗室開發(fā)的強大電子顯微鏡中成像，該顯微鏡向細(xì)胞表面發(fā)射一束離子，一點一點地研磨，同時為每一層新暴露的細(xì)胞拍照。然后，計算機程序?qū)⑦@些圖像拼接成三維重構(gòu)的圖像。

最后，研究人員疊加了兩個顯微鏡的三維圖像數(shù)據(jù)。結(jié)果：令人震驚的圖像以驚人的清晰度揭示了細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)節(jié)。

下面，此圖像的一些示例說明了科學(xué)家如何使用該技術(shù)。 “已經(jīng)引起了很多興趣，” Hess說， “還有很多實驗要做——整個世界的細(xì)胞都需要研究?！?/p>

全細(xì)胞相關(guān)成像。高壓冷凍細(xì)胞的低溫超高分辨率熒光顯微鏡與聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)結(jié)合使用，可以在全局超微結(jié)構(gòu)背景下對蛋白質(zhì)進(jìn)行多色三維納米可視化。 從左上方順時針方向：體積渲染的細(xì)胞，具有線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)蛋白相關(guān)的正交排列(插圖); 形態(tài)各異的溶酶體區(qū)室;由轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)報道分子定義的異染色質(zhì)亞結(jié)構(gòu)域;與小腦接觸處膜粗糙度相關(guān)的粘附蛋白顆粒神經(jīng)元;過氧化物酶體(粉紅色)與ER薄片(紅色)和線粒體(青色)并置。

在細(xì)胞開始(成年)之前(左)和之后(右)，神經(jīng)元的細(xì)胞核看起來截然不同。隨著細(xì)胞的成熟，DNA被重新包裝在細(xì)胞核內(nèi)以開啟新的一組基因。這些變化反映在兩個細(xì)胞內(nèi)部的灰色斑點和彩色熒光的不同模式中。 “這項技術(shù)為分化前后的細(xì)胞核狀態(tài)提供了驚人的詳細(xì)快照，”參與該項目的圣猶達(dá)兒童研究醫(yī)院的David Solecki表示。圖片來源：D. Hoffman et al./Science 2020

發(fā)育中的神經(jīng)元粘在一起。這段視頻準(zhǔn)確地展示了這些細(xì)胞是如何相互粘附的，揭示了類似瑞士奶酪一樣的聯(lián)系，幫助年輕的神經(jīng)元正確地遷移到它們在神經(jīng)系統(tǒng)中的最終目的地。黏附蛋白的紫色和綠色超分辨熒光圖像與電子顯微鏡下詳細(xì)顯示膜結(jié)構(gòu)的圖像相互關(guān)聯(lián)。資料來源: D. Hoffman et al./Science 2020

細(xì)胞內(nèi)充滿了小囊泡——這是一種膜囊，幫助細(xì)胞儲存蛋白質(zhì)、分解細(xì)胞垃圾和運輸貨物。僅在電子顯微鏡下，這些不同種類的囊泡是無法區(qū)分的。但通過cryo-SR / EM，它們的明顯特征變得清晰起來。這段視頻放大了核內(nèi)體，核內(nèi)體負(fù)責(zé)將貨物運送到細(xì)胞內(nèi)的不同區(qū)域。資料來源: D. Hoffman et al./Science 2020