懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)

一、 細(xì)胞傳代

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諔腋〖?xì)胞傳代技術(shù)。進(jìn)一步掌握細(xì)胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)原理：

培養(yǎng)細(xì)胞生長一定時(shí)間后，需分離再培養(yǎng)，否則細(xì)胞因生存空間不夠，細(xì)胞密度過大，致營養(yǎng)不足而引起細(xì)胞衰老、停止生長甚至死亡。為了維持細(xì)胞的存活和生長，必須進(jìn)行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)用品：

（一）儀器

凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；

（二）玻璃器皿

吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、廢液缸、

（三）塑料器皿

吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架

（四）其他物品

微量加樣槍、計(jì)數(shù)板、記號筆、移液槍

（五）試劑

1640培養(yǎng)液、PBS

操作步驟：

1. 準(zhǔn)備：

打開培養(yǎng)液，PBS；

取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。

2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。

3. 首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培養(yǎng)板孔中，輕輕吹打孔壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管。

4. 離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分，4-5分鐘。

5. 取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細(xì)胞，使之均勻懸浮。

6. 吸取1ML細(xì)胞懸液1ML轉(zhuǎn)入EP管中，備計(jì)數(shù)用。

7. 其余的細(xì)胞分別放入六個(gè)孔中，每孔約1ML。

8. 吸取培養(yǎng)液加入板孔中至1/3孔容量。

9. 鏡下觀察細(xì)胞是否分布均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

二、細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長曲線測定

培養(yǎng)細(xì)胞生長過程：潛伏期 指數(shù)增生期 停滯期

潛伏期(latent phase)

細(xì)胞接種后,先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形.然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24-96 小時(shí)或更長, 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24 小時(shí)。

(2) 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)

這是細(xì)胞增殖zui旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表示，即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)3％－5％。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力zui好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)zui佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的zui好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3－5 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少，zui后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。

（3）停滯期(Stagnate phase)

細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會脫落，嚴(yán)重的會發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時(shí)傳代。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.能獨(dú)立的進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)，會繪制生長曲線，了解細(xì)胞生長的發(fā)育特性。 
2. 學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長曲線

實(shí)驗(yàn)原理：

生長曲線的測定（計(jì)數(shù)法）是測定細(xì)胞生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。

為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中的細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，需連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常計(jì)數(shù)7天。為起見，一般每次計(jì)數(shù)三瓶細(xì)胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個(gè)部分。以存活細(xì)胞數(shù)對培養(yǎng)時(shí)間做圖，即生長曲線。 
生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細(xì)胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細(xì)胞技術(shù)的時(shí)間和次數(shù)依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?nbsp;
另外，測定生長曲線的常用方法還有MTT法。

計(jì)數(shù)板原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

操作步驟：

1. 將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板，放在鏡下觀察。

2. 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞從培養(yǎng)板孔轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘，棄去上清，加入PBS至一定體積（1ML）。

3. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4. 計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4 104

說明：公式中除以4，因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長） 1.0mm（寬） 0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

（注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新稀釋制備細(xì)胞懸液）

臺盼蘭染色操作步驟： 
1、制備細(xì)胞懸液，放入EP管中。
2、以1：1的比例加入0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。

凍存與復(fù)蘇

一、哺乳動物細(xì)胞冷凍保存

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的zui主要目的。

（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。

（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。

（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。

（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。

實(shí)驗(yàn)原理：

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。

實(shí)驗(yàn)用品：

（一）儀器

凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

（二）玻璃器皿

吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸；

（三）塑料器皿

吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）

（四）其他物品

 微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號筆、移液槍。

（五）試劑

1640培養(yǎng)液、DMSO（分析純）

K562細(xì)胞，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的一種。

操作步驟：

1. 準(zhǔn)備：

打開培養(yǎng)液，PBS；

取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。

2. 配制凍存液：吸取9ML培養(yǎng)液放入離心管，用移液槍吸取1ML DMSO溶液，逐滴緩慢加入離心管中。zui好把離心管插在冰中。

2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。

3. 吸出1個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培養(yǎng)板孔中，輕輕吹打孔壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管。

4. 離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)4-5分鐘。取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。輕輕吸出余下的培養(yǎng)液，注意勿吸出細(xì)胞沉淀。

5. 吸取1ML配制好的凍存液加入離心管，與細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)入凍存管。

6. 標(biāo)注： 標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期，凍存人。

7. 在4℃冰箱中放置 30 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16－18 小時(shí)；zui后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用凍存盒。

注意事項(xiàng)：

（1）凍存過程需緩慢

（2）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。

（3）細(xì)胞濃度控制在：1 107－5 107/ml。

（4）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，zui常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5－10％。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60。因?yàn)?，DMSO 能誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele）,淀粉等。

（5）DMSO 稀釋時(shí)會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。

細(xì)胞復(fù)蘇

操作步驟：

（一）準(zhǔn)備工作

1、37℃水浴

2、準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝5-10 ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)液離心管 。

（二）復(fù)蘇

1、帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持凍存管不斷搖動。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。

2、打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。

3、1000rpm離心5 min，棄去上清液。

4、沉淀中加入適當(dāng)培養(yǎng)基，37℃常規(guī)培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。

注意事項(xiàng)：

1. 解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕。

2. 解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，切不可直接用手，以免凍傷。

關(guān)注本網(wǎng)官方微信 隨時(shí)閱讀專業(yè)資訊