真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到大穩(wěn)定期后,一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天,培養(yǎng)細菌約需24~28小時,培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中,保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等,菌液濃度為109~1019個/ml,取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍,再于減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華至1%~5%,使培養(yǎng)物干燥。后將管口熔封,保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的為有效的方法之一,大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏,便于運輸。但操作過程復(fù)雜,并要求一定的設(shè)備條件。
礦物油中浸沒保藏此方法簡便有效,可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏,操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長,然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油,礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時,應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗,因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源,還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏,為了預(yù)防不測,一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗。
干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當(dāng)?shù)妮d體上,如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等,以保藏菌種。以沙土保藏用得較多,制備方法為:將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h,以除去其中所含的有機物,用水漂洗至中性,烘干,然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中,121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中,經(jīng)真空干燥8 h,于常溫或低溫下保藏均可,保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒,不需酸洗,經(jīng)風(fēng)干、粉碎,然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏,霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
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