不同非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法的對比

 

一、簡介

非洲豬瘟（Africann Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病1。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，是我國一類動物疫病和世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報告的動物疫病，受到世界各國的高度重視2。本病是以節(jié)肢動物作為傳播媒介的DNA病毒。ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發(fā)， 三全水餃事件 則將非洲豬瘟直接推向大眾的面前。目前，本病尚無有效的預(yù)防疫苗和治療藥物，防止疫情擴大的有效措施就是撲殺。因此事先建立簡便、快速、準確的ASFV檢測方法顯得十分必要。本文就ASFV實驗室檢測的不同方法，進行對比分析。

二、檢測方法2.1 血清學檢測方法

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA利用抗原抗體進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測，應(yīng)用于血清抗體的檢測，適用于大批量樣品的檢測。ASFV含有約150種蛋白，目前國內(nèi)外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等3。

優(yōu)點：快速、方便。

缺點：（1）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內(nèi)， 7天后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的Ig G抗體，而7天的時候，足以出現(xiàn)早期臨床癥狀，并已經(jīng)傳染給其他家豬，因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性。（2）針對不同蛋白會出現(xiàn)個別差異，增加排查的難度3。

2.1.2膠體金免疫層析（GICA）試紙條

運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體, 應(yīng)用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條，也稱為檢測卡。

優(yōu)點：使用方便；

缺點：（1）靈敏度低；（2）一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內(nèi)， 7天后才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的Ig G抗體，而7天的時候，足以出現(xiàn)早期臨床癥狀，并已經(jīng)傳染給其他家豬，因此該檢測方法往往具有難以解決的滯后性3。

2.1.3熒光抗體試驗（FAT）

熒光抗體試驗（FAT）可用于檢測野外可疑豬或?qū)嶒炇医臃N豬的脾、淋巴結(jié)等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。

優(yōu)點：敏感性和特異性較佳；

缺點：需要專業(yè)試驗人員，同時需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法4。

2.1.4免疫組化法

該方法用來檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學變化，通過檢測發(fā)現(xiàn)，感染ASFV豬有出血、單核細胞增多現(xiàn)象。免疫組化法對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。

優(yōu)點：特異性較佳；

缺點：對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度4。

2.2分子生物學檢測方法

2.2.1 PCR

體外擴增基因的一種方法，是目前ASFV常用的實驗室檢測方法。研究表明，非洲豬瘟感染8小時， 便可從血液中檢測到其核酸物質(zhì)，因此針對非洲豬瘟病毒保守區(qū)域設(shè)計引物，對采集的血液或組織病料等相關(guān)物質(zhì)進行DNA提取，進行PCR反應(yīng)，可對其進行快速準確診斷。是目前ASFV最常用的實驗室檢測方法。眾多國內(nèi)外研究5-9均建立了ASFV的PCR檢測方法，表明該方法具有良好的敏感性和特異性，且可以檢測出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。

優(yōu)點：簡單快速、靈敏度高和特異性強。

2.2.2 熒光定量PCR

通俗講是PCR的升級版。實時熒光定量PCR比常規(guī)PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時快速檢測大批量樣品，其更加敏感、準確。舉例，McKillen等10（2010）根據(jù)9GL基因建立了MGB探針實時熒光定量PCR檢測方法，最低可以檢測到20拷貝標準DNA。

優(yōu)點：敏感性和特異性高。

2.2.3 探針雜交技術(shù)

能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結(jié)果， 省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標板中可批量反應(yīng)，為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑，

該方法的建立難度較高、操作較繁瑣， 對實驗人員技術(shù)水平要求較高。

三、小結(jié)目前，ASFV的檢測技術(shù)主要有針對病毒DNA的核酸檢測技術(shù)和基于病毒抗原、抗體反應(yīng)的免疫學技術(shù)兩大類。OIE推薦檢測ASFV的方法主要有PCR、實時熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測方法存在一定的局限性和滯后性。PCR、實時熒光定量PCR等分子生物學技術(shù)在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在ASFV的早期檢測中具有重要作用?？傊?，ASFV的實驗室檢測方法多種多樣，但若要求檢測結(jié)果準確、快速、敏感，我們推薦PCR、實時熒光定量PCR的方法，這不僅對感染ASFV的動物治療非常重要，而且對未感染的動物及時采取有效的預(yù)防措施同樣具有重要的意義。隨著免疫學與分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，ASFV的實驗室檢測方法必將不斷完善，進一步為我國開展ASF的監(jiān)測與綜合防控提供技術(shù)支持。

 

 

【參考文獻】

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9. Basto AP, Portugal RS, Nix RJ, Cartaxeiro C, Boinas F, Dixon LK, et al. Development of a nested PCR and its internal control for the detection of African swine fever virus (ASFV) in Ornithodoros erraticus. Archives of Virology 2006; 151 (4):819-826.

10. Mckillen J, Mcmenamy M, Hjertner B, Mcneilly F, Uttenthal , Gallardo C, et al. Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5 conjugated minor groove binder probe. Journal of Virological Methods 2010; 168 (1):141-146.

 

（來源：無錫百泰克生物技術(shù)有限公司）

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