MB10103.5 v.A

 

 植物琥珀酸脫氫酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

 

主要用途

 

 植物琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用合成電子受體染料，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定染料還原后峰值的降低，即采用比色法測(cè)算樣品中單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）等裂解懸液中琥珀酸脫氫酶的特異性活性檢測(cè)。用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細(xì)胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細(xì)胞呼吸鏈。琥珀酸脫氫酶由27kd和70kd兩個(gè)單體組成。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過(guò)黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子?；阽晁崦摎涿傅姆磻?yīng)原理，使用人工電子受體染料二氯靛酚鈉（2,6-Dichloroindophenol sodium；DCIP），接受來(lái)自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH2）的電子，而被還原，在分光光度儀下，其吸光值（600nm波長(zhǎng)）的變化，來(lái)測(cè)算琥珀酸脫氫酶的活性。其反應(yīng)方式為：

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 清理液（Reagent A）  毫升

 裂解液（Reagent B）  毫升

 緩沖液（Reagent C）  毫升

 反應(yīng)液（Reagent D）  毫升

 底物液（Reagent E）    毫升

 陰性液（Reagent F）  微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)    1份

 

保存方式

 

保存 清理液（Reagent A）和 緩沖液（Reagent C）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融； 反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸； 底物液（Reagent E），避免光照，有效保證6月

 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測(cè)定的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent E）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管（選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次即刻用刀片切碎組織放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管加入預(yù)冷的xx毫升 裂解液（Reagent B）渦旋震蕩5秒，充分混勻即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）即刻移入到1.5毫升離心管移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、測(cè)定準(zhǔn)備

 

準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)600nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

 

背景對(duì)照測(cè)定

 

移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）加入xx微升 底物液（Reagent E）放進(jìn)25℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘加入xx微升 陰性液（Reagent F）上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：OD0分鐘－OD5分鐘 

 

樣品活性測(cè)定

 

移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D）加入xx微升 底物液（Reagent E）放進(jìn)25℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘加入100微升待測(cè)樣品（注意：100微克組織總蛋白；樣品須溶解）上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：OD0分鐘－OD5分鐘

 

計(jì)算樣品活性

 

注意事項(xiàng)

 

本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照測(cè)定操作時(shí)，須戴手套 反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次加入樣品后3秒內(nèi)即刻比色測(cè)定比色測(cè)定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.8左右為理想狀態(tài)反應(yīng)1分鐘后比色測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定持續(xù)5分鐘測(cè)定值由高到低變化，即5分鐘測(cè)定讀數(shù)低于0分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底建議待測(cè)樣本組織總蛋白濃度為100微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）活性計(jì)算時(shí)，可以選擇5分鐘內(nèi)單位時(shí)間zui大線性變化的吸光值琥珀酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾氧化型二氯靛酚鈉（DCIP）所需的酶量作為一個(gè)活性單位本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

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