基本原理

        抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。
分類

1、免疫熒光方法

        zui早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用比較廣

2、免疫酶標(biāo)方法

       免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前定位準(zhǔn)確、對比度好、染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬PAP法（過氧化物酶-抗過氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物）、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）、即用型二步法（聚合物鏈接）等。

3、免疫膠體金技術(shù)

        免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。

4、免疫鐵蛋白法

5、放射免疫自顯影法

          在病理科，利用特異的腫瘤標(biāo)志物，醫(yī)生通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性，確定腫瘤的分期和分級，并確定細胞類型和轉(zhuǎn)移的來源，以便找到原發(fā)腫瘤的位置。同樣，IHC也能用于藥物開發(fā)，通過檢測疾病靶點的上調(diào)或下調(diào)來判斷藥物療效。

         免疫組化指的是根據(jù)抗體與抗原特異結(jié)合的原理來檢測組織切片中的抗原（如蛋白）。immuno的詞根來自操作中所使用的抗體，而histo意味著組織。另一種類似的技術(shù)是免疫細胞化學(xué)（Immunocytochemistry，簡稱ICC）。這兩個詞大家經(jīng)?；熘?，看著好像差不多，但實際上還是有點區(qū)別。這里順便說說。

IHC vs ICC

對于IHC，組織是來自患者或動物，經(jīng)過冷凍或石蠟包埋。將這些組織制成約4 m厚的切片，封片后再處理。通過這種方法，研究人員可觀察細胞組分的定位，同時維持周圍組織的原先結(jié)構(gòu)。

對于ICC，大部分細胞外基質(zhì)及其他基質(zhì)組分被去除，只剩下整個細胞來染色。ICC的來源可以是細胞懸液，來自患者或動物（如血涂片、拭子等），或在實驗室中進行的組織培養(yǎng)細胞系。

除了生物學(xué)來源，IHC和ICC在樣品處理的程度上也有所不同。ICC需要透化，要么通過固定過程，要么是單獨的透化步驟，這樣抗體才能與細胞內(nèi)的靶點相結(jié)合。而IHC可能不要單獨的透化步驟，這取決于切片的厚度和固定方法。包埋在石蠟中的IHC切片必須進一步處理，才能進行抗體染色。一旦處理好樣品，IHC和ICC的染色操作就幾乎沒什么差異了。當(dāng)然，就染色而言，根據(jù)所使用的抗體來優(yōu)化還是少不了的。

設(shè)計一個成功的IHC/ICC實驗

從技術(shù)上講，IHC的原理很簡單。首先固定樣品，以保留細胞完整性，之后與封閉液共同孵育，避免抗體的非特異結(jié)合。隨后將樣品先后與一抗和二抗孵育，并通過顯微鏡分析觀察信號。

然而，這并不意味著實驗很好做。zui大的挑戰(zhàn)在于如何確定zui佳的實驗條件，讓每個抗原都產(chǎn)生強烈而特異的信號。如果是個高豐度蛋白，那么挺好辦，需要的固定時間短，封閉時間短，可以用熒光標(biāo)記一抗直接檢測。但如果要檢測冰凍切片中的磷酸化蛋白呢？那可能需要抗原修復(fù)，外加放大檢測。

IHC/ICC實驗設(shè)計和優(yōu)化的變量，如下表：

變量

因素

抗原

物種、表達水平、樣品類型 
亞細胞定位

表位

取決于構(gòu)象和翻譯后修飾

樣品類型

組織或細胞

樣品制備

組織：石蠟或冰凍

細胞：貼壁細胞或細胞懸液

適當(dāng)對照

無一抗、同型對照、吸附對照、組織類型對照

固定方法

灌注或浸泡

固定劑

甲醛、醇類或丙酮

封閉液

正常血清、牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉

抗原修復(fù)

蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)（PIER）或熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（HIER）

檢測方法

直接或間接（有無放大）

一抗

單克隆或多克隆

二抗

物種和標(biāo)記

標(biāo)記方法

熒光或顯色

標(biāo)記

熒光染料、DAB、AEC

復(fù)染劑

熒光：DAPI

顯色：蘇木精

封片劑

熒光：抗淬滅封片劑

顯色：水性封片劑

觀察 分析

熒光顯微鏡或標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)顯微鏡

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